第五章-反膠團(tuán)萃取

第五章

反膠團(tuán)萃取與雙水相萃取2013.2第一節(jié)、反膠團(tuán)萃取基本要求：1、掌握反膠團(tuán)的構(gòu)造、反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性及制備2、反膠團(tuán)萃取原理，了解反膠團(tuán)在分離工藝中的應(yīng)用。重點(diǎn)：反膠團(tuán)萃取原理。難點(diǎn)：反膠團(tuán)的構(gòu)造；反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性及制備。第一節(jié)反膠團(tuán)萃取一、概述傳統(tǒng)的萃取，難以應(yīng)用于一些生物活性物質(zhì)的提取與分離。因?yàn)榻^大多數(shù)蛋白質(zhì)不溶于有機(jī)溶劑，若使蛋白質(zhì)接觸有機(jī)溶劑，會引起蛋白質(zhì)的變性。另外，蛋白質(zhì)分子表面帶有許多電荷，普通的離子締合型萃取難以奏效，因次研究和開發(fā)易與工業(yè)化的、高效的生化物質(zhì)分離方法已成為當(dāng)務(wù)之急。反膠團(tuán)萃?。╮eversedmicellarextrceion）就是在這一背景下發(fā)展起來的一種新型分離技術(shù)。1977年，瑞士學(xué)者Luisi等人首次提出用反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)，但未引起人們的廣泛關(guān)注。直到20世紀(jì)80年代生物學(xué)家們才開始認(rèn)識到反膠團(tuán)萃取的重要性。反膠團(tuán)萃取的本質(zhì)仍然是液液萃取，但與一般溶劑萃取所不同的是，反膠團(tuán)萃取是利用表面活性劑在有機(jī)溶劑相中形成反膠團(tuán)進(jìn)行萃取，即反膠團(tuán)在有機(jī)相內(nèi)形成一個(gè)親水微環(huán)境，使蛋白質(zhì)類生物活性物質(zhì)溶解于其中，從而避免在有機(jī)相中發(fā)生不可逆變性的現(xiàn)象。此外，構(gòu)成反膠團(tuán)的表面活性劑往往具有溶解細(xì)胞的能力，因此可以用于直接從完整細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)和酶，省卻了細(xì)胞破壁。1、反膠團(tuán)的形成及特性膠團(tuán)和反膠團(tuán)的形成膠團(tuán)或反膠團(tuán)的形成均是表面活性劑分子自聚的結(jié)果，是熱力學(xué)穩(wěn)定體系。將表面活性劑溶于水中，當(dāng)其濃度超過臨界膠團(tuán)濃度（criticalmicelleconcentration,CMC）時(shí)，表面活性劑就會在水溶液中聚集在一起形成聚集體，稱為膠團(tuán)（micelles）。水溶液中膠團(tuán)的表面活性劑的極性基團(tuán)向外與水相接觸，而非極性基團(tuán)在內(nèi)，形成一個(gè)非極性的核心，此核心可以溶解非極性物質(zhì)。若有機(jī)溶劑中加入表面活性劑，當(dāng)其濃度超過臨界濃度時(shí)，就會在有機(jī)相中也形成聚集體，稱為反膠團(tuán)。在反膠團(tuán)中，表面活性劑的非極性基團(tuán)在外，與有機(jī)相接觸，而極性基團(tuán)則排列在內(nèi)形成一個(gè)極性核（polarcore）。此極性核具有溶解極性物質(zhì)的能力，極性核溶解水后，就形成“水池”。由于周圍水層和極性基團(tuán)的保護(hù)，保持了蛋白質(zhì)的天然構(gòu)型，不會造成失活。反膠團(tuán)：是兩性表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑中親水性基團(tuán)自發(fā)地向內(nèi)聚集而成的、內(nèi)含微小水滴的、空間尺度僅為納米級的集合型膠體。是一種自我組織和排列而成的，并具熱力學(xué)穩(wěn)定的有序構(gòu)造。反膠團(tuán)的微小界面和微小水相具有兩個(gè)特異性功能：(1)具有分子識別并允許選擇性透過的半透膜的功能；(2)在疏水性環(huán)境中具有使親水性大分子如蛋白質(zhì)等保持活性的功能。

反膠團(tuán)萃取技術(shù)在分離生物大分子特別是分離蛋白質(zhì)方面，具有突出優(yōu)點(diǎn)：

（1）有很高的萃取率和反萃取率并具有選擇性；（2）分離、濃縮可同時(shí)進(jìn)行，過程簡便；（3）能解決蛋白質(zhì)（如胞內(nèi)酶）在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問題；（4）由于構(gòu)成反膠團(tuán)的表面活性劑往往具有細(xì)胞破壁功效，因而可直接從完整細(xì)胞中提取具有活性的蛋白質(zhì)和酶；（5）反膠團(tuán)萃取技術(shù)的成本低，溶劑可反復(fù)使用等。

反膠團(tuán)的應(yīng)用研究：（1）作為生物膜的簡化模型；（2）作為顯示酶類性質(zhì)的一種模型進(jìn)行基礎(chǔ)性研究；（3）作為具有新型功能的疏水性反應(yīng)場；（4）作為酶和微生物的一種新型的固定化方法；（5）作為微小型的生物反應(yīng)器；（6）作為生理活性物質(zhì)及生物活性大分子的特異性分離場的應(yīng)用性研究。2、反膠團(tuán)的構(gòu)造1)、反膠團(tuán)的構(gòu)造向非極性溶劑中加入表面活性劑時(shí)，當(dāng)表面活性劑的濃度超過一定的數(shù)值時(shí)，會在非極性溶劑內(nèi)形成表面活性劑的聚集體。與在水相中不同的是，非極性溶劑內(nèi)形成的表面活性劑聚集體，其疏水性的非極性尾部向外，指向非極性溶劑，而極性頭向內(nèi)，與在水相中形成的微膠團(tuán)方向相反，因而稱之為反膠團(tuán)或反向膠團(tuán)。

圖是表面活性劑聚集體的可能的微觀構(gòu)造極性“頭”水非極性的“核”非極性“尾”正膠團(tuán)：表面活性劑的極性頭朝外，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成非極性的“核”極性“頭”有機(jī)溶劑極性的“核”非極性“尾”反膠團(tuán)：表面活性劑的極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”

在反膠團(tuán)中有一個(gè)極性核心，它包括由表面活性劑極性端組成的內(nèi)表面、平衡離子和水，被稱之為“水池”。因?yàn)檫@個(gè)“水池”具有極性，可以溶解具有極性的分子和親水性的生物大分子，而極性分子和/或親水性的生物大分子也因此可＂溶解＂在非極性的有機(jī)溶劑中。

3、常用表面活性劑表面活性劑的存在是構(gòu)成反膠團(tuán)的必要條件，有三類表面活性劑都可在非極性溶劑中形成反膠團(tuán)。

（1）陰離子型表面活性劑（2）陽離子型表面活性劑（3）非離子型表面活性劑常用的表面活性劑及其相應(yīng)的有機(jī)溶劑

在反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)使用最多的是陰離子型表面活性劑AOT，AOT容易獲得，它具有雙鏈，形成反膠團(tuán)時(shí)無需添加輔助表面活性劑且有較好的強(qiáng)度；它的極性基團(tuán)較小，所形成的反膠團(tuán)空間較大，有利于生物大分子進(jìn)入。3、反膠團(tuán)的分類1）、單一表面活性劑反膠團(tuán)體系：是指在使用時(shí)無須加入助劑的表面活性劑，具有多條中等長度的烷基尾和一個(gè)較小的極性頭。A、陰離子型，如AOT。該體系結(jié)構(gòu)簡單和穩(wěn)定，反膠團(tuán)體積較大，適用于等電點(diǎn)較高的、相對分子量較小的蛋白質(zhì)的分離；

B、陽離子型，如CTAB，DAP等。該體系適用于等電點(diǎn)較低的、相對分子量較大的蛋白質(zhì)的分離；C、非離子型表面活性劑，能形成更大的反膠團(tuán)體系，能分離相對分子量更大的蛋白質(zhì)，但這類體系容易乳化。2）、混合表面活性劑反膠團(tuán)體系：是指兩種或兩種以上表面活性劑構(gòu)成的體系，一般來說，混合表面活性劑反膠團(tuán)對蛋白質(zhì)有更高的分離效率。3）、親和反膠團(tuán)體系：是指除了有組成反膠團(tuán)的表面活性劑以外，還有具有親和特征的助劑，它的親和配基與蛋白質(zhì)有特異的結(jié)合能力，往往極少量親和配基的加入就可使萃取蛋白質(zhì)的選擇性大大提高。

二、反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性及制備1、反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性影響反膠團(tuán)的大小的因素：表面活性劑和非極性有機(jī)溶劑的種類、濃度；操作時(shí)體系的溫度、壓力；微小水池中的離子強(qiáng)度等。（1）反膠團(tuán)的臨界膠團(tuán)濃度表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑相中能形成反膠團(tuán)的最小濃度稱為臨界膠團(tuán)濃度（CMC）。大多數(shù)在0.1~1.0mmol/L之間。CMC與表面活性劑的種類有關(guān)。

見下表某些表面活性劑的臨界膠束濃度／(mol／L)（2）反膠團(tuán)含水率W：W用水和表面活性劑的摩爾濃度之比來定義，即：

C[水]

W=

C[表面活性劑]

如表面活性劑是AOT，則C[水]W=

C[AOT]W越大，反膠團(tuán)的半徑越大。

當(dāng)W<6-8時(shí)，“水池”（微水相）中水分子被表面活性劑親水基團(tuán)強(qiáng)烈地束縛，其表觀粘度可增大到普通水粘度的50倍，且疏水性非常強(qiáng)。另外，其冰點(diǎn)通常低于0℃。這一部分水使表面活性劑的親水性基團(tuán)水合化，即被牢固地束縛著，所以粘度很大，流動性很差。在AOT反膠團(tuán)中，水合化一分子AOT需要6~8個(gè)水分子，而其它水分子則不受束縛，可與普通水一樣自由流動。故當(dāng)W>16時(shí)，“水池”中的水逐漸接近主體水相粘度，膠團(tuán)內(nèi)也形成二重電荷層。見下圖。假定反膠團(tuán)為球形（除了W或表面活性劑濃度很大外），反膠團(tuán)平均直徑dm的增加和W的增加基本成正比，W=0~50之間，dm=2~30nm。AOT的Wmax=60，若W值再增大，反膠團(tuán)溶液變渾濁，并開始分層。2、反膠團(tuán)的制備制備反膠團(tuán)系統(tǒng)一般有以下三種方法：（1）注入法

將含有蛋白質(zhì)的水溶液直接注入到含有表面活性劑的非極性有機(jī)溶劑中去，然后進(jìn)行攪拌直到形成透明的溶液為止。該方法過程快，并能較好地控制反膠團(tuán)的平均直徑和含水量。（2）相轉(zhuǎn)移法將酶或蛋白質(zhì)從主體水相轉(zhuǎn)移到含表面活性劑的非極性有機(jī)溶劑中形成反膠團(tuán)-蛋白質(zhì)溶液，即把含有表面活性劑的有機(jī)相和含有蛋白質(zhì)的水相接觸，在緩慢的攪拌下，一部分蛋白質(zhì)緩慢轉(zhuǎn)入（萃入）有機(jī)相。

該過程較慢，但形成的體系處于穩(wěn)定的熱力學(xué)平衡狀態(tài)，有利于在有機(jī)溶劑相中獲得較高的蛋白質(zhì)濃度。（3）溶解法

將含有反膠團(tuán)（W＝3~30）的有機(jī)溶液與蛋白質(zhì)固體粉末一齊攪拌，使蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)中。用于非水溶性蛋白質(zhì)。該法所需時(shí)間較長，含蛋白質(zhì)的反膠團(tuán)體系穩(wěn)定。

說明反膠團(tuán)“水池”中的水與普通水的性質(zhì)有區(qū)別。

三、

生理活性物質(zhì)的分離濃縮

反膠團(tuán)萃取原理蛋白質(zhì)的溶解反膠團(tuán)的萃取1、反膠團(tuán)萃取原理從宏觀上看反膠團(tuán)萃取，是有機(jī)相－水相間的分配萃取，和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。微觀上，是從主體水相向溶解于有機(jī)溶劑相中的反膠團(tuán)微水相中的分配萃取。從原理上，可當(dāng)做“液膜”分離操作的一種。如下圖所示：2、反膠團(tuán)萃取特點(diǎn)（1）進(jìn)入有機(jī)相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，從而避免了與有機(jī)溶劑相直接接觸而引起的變性，失活。（2）pH、離子強(qiáng)度、表面活性劑濃度等（如下表）因素會對反膠團(tuán)萃取產(chǎn)生影響。通過對它們的調(diào)整，對分離場（反膠團(tuán)）—待分離物質(zhì)（生物大分子等）的相互作用加以控制，能實(shí)現(xiàn)對目的物質(zhì)高選擇性的萃取和反萃取。（3）有機(jī)相內(nèi)反膠團(tuán)中微水相體積最多僅占有機(jī)相的幾個(gè)百分點(diǎn)，所以它同時(shí)也是一個(gè)濃縮操作。

3、影響反膠團(tuán)萃取生物分子的主要因素

（1）水相pH值的影響表面活性劑的極性頭是朝向反膠團(tuán)的內(nèi)部，使反膠團(tuán)的內(nèi)壁帶有一定的電荷，而蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)，水相的pH值決定了蛋白質(zhì)分子表面可電離基團(tuán)的離子化程度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所帶電荷與反膠團(tuán)內(nèi)所帶電荷的性質(zhì)相反時(shí)，由于靜電引力，可使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到反膠團(tuán)中。相反，當(dāng)水相pH大于等電點(diǎn)時(shí)，由于靜電斥力，使溶入反膠團(tuán)的蛋白質(zhì)反向萃取出來，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的反萃取。

（2）水相離子強(qiáng)度的影響

a：離子強(qiáng)度影響到反膠團(tuán)內(nèi)壁的靜電屏蔽的程度，降低了蛋白質(zhì)分子和反膠團(tuán)內(nèi)壁的靜電作用力。b：減小了表面活性劑極性頭之間的相互斥力，使反膠團(tuán)變小。這兩方面的效應(yīng)都會使蛋白質(zhì)分子的溶解性下降，甚至使已溶解的蛋白質(zhì)從反膠團(tuán)中反萃取出來。

（3）助表面活性劑的影響蛋白質(zhì)的分子量往往很大，超過幾萬或幾十萬，使表面活性劑形成的反膠團(tuán)的大小不足以包容大的蛋白質(zhì)，而無法實(shí)現(xiàn)萃取，此時(shí)加入一些非離子表面活性劑，使它們插入反膠團(tuán)結(jié)構(gòu)中，就可以增大反膠團(tuán)的尺寸，溶解相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)。

（4）溶劑體系的影響溶劑的性質(zhì)，尤其是極性，對反膠團(tuán)的形成和大小都有影響。常用的溶劑有：烷烴類（正己烷、環(huán)己烷、正辛烷、異辛烷等）。有時(shí)也使用助溶劑，如醇類?？梢哉{(diào)節(jié)溶劑體系的極性，改變反膠團(tuán)的大小，增加蛋白質(zhì)的溶解度。4、蛋白質(zhì)的溶解蛋白質(zhì)向非極性溶劑中反膠團(tuán)的納米級水池中的溶解，有下圖所示的四種可能。（1）為水殼模型；（2）蛋白質(zhì)中的親脂部分直接與非極性溶劑的碳?xì)浠衔锵嘟佑|；（3）蛋白質(zhì)被吸附在微膠團(tuán)的“內(nèi)壁”上；（4）蛋白質(zhì)被幾個(gè)微膠團(tuán)所溶解，微膠團(tuán)的非極性尾端與蛋白質(zhì)的親脂部分直接作用。在水殼模型中，蛋白質(zhì)居于“水池”的中心，水殼層保護(hù)了蛋白質(zhì)，使它的生物活性不會改變。蛋白質(zhì)表面電荷與反膠團(tuán)內(nèi)表面電荷間的靜電作用是使蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)的重要因素，因此凡能影響靜電作用的因素都會影響蛋白質(zhì)的溶入，如水溶液的pH、離子強(qiáng)度等。5、反膠團(tuán)萃取與反膠團(tuán)萃取有關(guān)的因素如表5-1.因分離中使用的表面活性劑種類不同，如陰離子型和陽離子型，其相互作用和分離原理也會不同。應(yīng)用較多的反膠團(tuán)體系為：AOT/異辛烷體系。以立體性、靜電性、疏水性相互作用的分離特性及效果歸納如下：

1）、氨基酸分離特性氨基酸分子量與反膠團(tuán)相比太小，不存在反膠團(tuán)-氨基酸分子間的立體性相互作用和分子間的大小識別，實(shí)際是通過AOT-氨基酸分子間的相互作用進(jìn)行萃取的。但由于氨基酸因pH不同而發(fā)生正負(fù)電荷的變化和帶有疏水性殘基，所以，以靜電和疏水性相互作用來定量評價(jià)氨基酸的萃取特性和效果。各種氨基酸隨pH值的變化，實(shí)際電荷量的變化和氨基酸萃取率變化之間的關(guān)系如圖8-6。如圖，平均每單位正電荷量、每分子AOT，萃入的氨基酸分子數(shù)是一固定值，該值由氨基酸種類決定。氨基酸殘基的疏水性越大，該值越大。2）、酶、蛋白質(zhì)萃取特性酶、蛋白質(zhì)等生物大分子的空間尺度與反膠團(tuán)的大小相接近，故存在立體性相互作用。各種相互作用都很重要，在大多數(shù)情況下，是它們之間的復(fù)合作用。有些蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生很小的變化時(shí)，就可能對這些相互作用的結(jié)果產(chǎn)生很大影響。（1）靜電性相互作用以下表所示的酶、蛋白質(zhì)為例，考察萃取或反萃取時(shí)靜電性相互作用以及pH對這種作用的影響。①小分子蛋白質(zhì)（Mr<20000）當(dāng)pH>pI時(shí)，蛋白質(zhì)不能溶入膠團(tuán)內(nèi)，但在等電點(diǎn)附近，急速變?yōu)榭扇?。?dāng)pH<pI時(shí)，即在蛋白質(zhì)帶正電荷的pH范圍內(nèi)，它們幾乎完全溶入膠團(tuán)內(nèi)。②蛋白質(zhì)分子量增大到一定程度，即使將pH向酸性一側(cè)偏離pI，萃取率也會降低（即立體性相互作用效果增大）。

③分子量更大的BSA，全pH范圍內(nèi)幾乎都不能萃?。挫o電相互作用效果無限小，可忽略不計(jì)）。此時(shí)，AOT濃度如從通常條件（50~100mmol/L）增加到200~500mmol/L，逐漸變?yōu)榭奢腿?。④降低pH，正電荷量增加，萃取率從某一pH開始，急速減小。這是因?yàn)閜H導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性造成的。蛋白質(zhì)和微量的AOT在靜電、疏水性等的相互作用下，在水相中形成了復(fù)合體而變性。⑤添加KCl等無機(jī)鹽，因離子強(qiáng)度的增加和靜電屏蔽的作用，而使靜電性相互作用變?nèi)?，一般地，萃取率下降?/p>

添加KCl等無機(jī)鹽，對有機(jī)相具有脫水作用（W減?。?，使立體性相互(排除)作用增大。

（2）立體性相互作用（空間位阻）隨蛋白質(zhì)分子量的增大，蛋白質(zhì)分子和膠團(tuán)間的立體性相互作用增加，萃取率下降。

反膠團(tuán)粒徑并非一致，存在一粒徑分布。反膠團(tuán)的粒徑分布（分離場）隨鹽濃度和AOT濃度的增加而發(fā)生顯著的變化。蛋白質(zhì)溶入與否，對它幾乎沒有影響。

即使萃取溶入膠團(tuán)的蛋白質(zhì)的種類和分子量不同，分離場的特性（膠團(tuán)平均直徑和含水率）幾乎不變。隨著蛋白質(zhì)分子量的增加，分配系數(shù)KpI（蛋白質(zhì)等電點(diǎn)處的分配系數(shù)）迅速下降?？梢哉J(rèn)為相對分子量20000左右的蛋白質(zhì)的高效分離是通過立體性相互作用來實(shí)現(xiàn)的。（3）其它的相互作用

關(guān)于疏水性相互作用和特異性相互作用，還研究不多。一般認(rèn)為疏水性相互作用對蛋白質(zhì)分配特性的影響不大。四、在分離工藝中的應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)分離

利用圖8-8和圖8-9的靜電相互作用，通過三步分離核糖核酸a、細(xì)胞色素c和溶菌酶。調(diào)整pH，進(jìn)行正萃取分離，通過控制KCl濃度，反萃取分離，獲得較好地分離效果和收率。第一步：在pH=9.0和較低的鹽濃度下，核糖核酸酶a帶負(fù)電荷，不能被反膠團(tuán)萃取，留在水相中，而細(xì)胞色素C和溶菌酶由于都帶正電荷，被萃取到反膠團(tuán)中。第二步：利用提高離子強(qiáng)度，將細(xì)胞色素C反萃到水相中，而溶菌酶仍留在反膠團(tuán)中。第三步：進(jìn)一步提高pH值和離子強(qiáng)度，將溶菌酶反萃到水相中。2、濃縮α-淀粉酶

使用如圖8.14所示，用2個(gè)混合槽和2個(gè)澄清槽組成連續(xù)萃取/反萃取流程，用TOMAC/0.1%(v/v)辛醇-異辛烷的反膠團(tuán)體系循環(huán)萃取分離α-淀粉酶，控制第一級水相中酶濃度在較低水平上，使失活速度很小，將α-淀粉酶濃縮了8倍，酶活力損失約30%。對該過程優(yōu)化，在反膠團(tuán)中加入非表面活性劑，以提高分配系數(shù)，同時(shí)加大攪拌速度，以提高傳質(zhì)速率，第二級反萃液中α-淀粉酶的活力回收率為84%，濃縮了17倍。

3、直接提取胞內(nèi)酶

用反膠團(tuán)直接從全發(fā)酵液中提取和純化棕色固氮菌的胞內(nèi)脫氫酶：將全細(xì)胞的懸浮液注入CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）/己醇-辛烷反膠團(tuán)溶液中，完整的細(xì)胞在表面活性劑的作用下，析出酶進(jìn)入反膠團(tuán)的“水池”中，經(jīng)反萃取，可選擇性地回收濃度很高的酶。該技術(shù)不利的一面是細(xì)胞碎片留在反膠團(tuán)中，使得反膠團(tuán)不能循環(huán)利用，但如果能夠便利地回收有機(jī)溶劑和表面活性劑，那么這種細(xì)胞溶解和蛋白質(zhì)萃取相結(jié)合的工藝方法，將成為從細(xì)胞中直接提取蛋白質(zhì)的重要途徑。4、反膠團(tuán)萃取用于蛋白質(zhì)的復(fù)性

反膠團(tuán)萃取的另一個(gè)應(yīng)用是蛋白質(zhì)的復(fù)性。重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的大部分蛋白質(zhì)，須溶于強(qiáng)變性劑中，以便從細(xì)胞中抽提出來。除去變性劑，進(jìn)行復(fù)性的過程通常要在極稀的溶液中進(jìn)行，以避免部分復(fù)性中間體的凝集。利用反膠團(tuán)包裹變性的蛋白質(zhì)，通過調(diào)整系統(tǒng)組成的環(huán)境參數(shù)，使得每個(gè)微膠團(tuán)只包裹一個(gè)蛋白質(zhì)分子，然后改變膠團(tuán)溶液組成進(jìn)行復(fù)性，由于蛋白質(zhì)被單獨(dú)裝在各個(gè)膠團(tuán)中，復(fù)性時(shí)完全不接觸，避免了有害作用，使酶的活性完全恢復(fù)。

5、從植物中提取油和蛋白質(zhì)用烴類有機(jī)溶劑對植物種子進(jìn)行反膠團(tuán)萃取，油被直接萃入有機(jī)相，蛋白質(zhì)卻萃入反膠團(tuán)的“水池”中。先用水溶液反萃取得到蛋白質(zhì)，溶液再經(jīng)冷卻使表面活性劑沉淀分離，最后用蒸餾的方法將油和烴類分離。實(shí)驗(yàn)證明該方法相當(dāng)優(yōu)越。

6、分離膜型的反膠團(tuán)萃取

分離膜型的液-液反膠團(tuán)萃取是混合分離型的改進(jìn)型，以疏水性多孔質(zhì)膜（接觸比表面積較大，30~300cm2/cm3)作為液液兩相的接觸界面。在膜的內(nèi)外兩側(cè)，分別流過含有蛋白質(zhì)的水相和含有反膠團(tuán)的有機(jī)相，液液界面靠膜兩側(cè)的壓力差保持。因膜自身對蛋白質(zhì)透過無選擇性，與反膠團(tuán)萃取分離法具有相同的原理。其優(yōu)點(diǎn)是：沒有在一般連續(xù)性液液萃取法中成為問題的進(jìn)料和液泛等制約因素，可自由地改變液流的流速；總物質(zhì)移動速度和膜面積比一般方法大；在原理上是連續(xù)式的，放大也較容易。五、在液膜分離法中的應(yīng)用利用含有反膠團(tuán)的有機(jī)相作為液膜，從一水相中向另一水相中選擇性地輸送生理活性物質(zhì)的液膜分離方法，和通常的液液萃取法相比，具有以下一些特征：正萃取和反萃取能同時(shí)在一個(gè)裝置內(nèi)進(jìn)行，表面活性劑的使用量及其損失較少，從原理上來看，速度差分離也是可能的。

六、反膠團(tuán)萃取設(shè)備要實(shí)現(xiàn)反膠團(tuán)萃取的工業(yè)化，關(guān)鍵之一是開發(fā)適用于反膠團(tuán)萃取的高效分離設(shè)備。1、膜萃取器膜萃取器有管狀超濾膜和中空纖維膜兩種。（1）管狀超濾膜用管狀陶瓷超濾膜截留含有磷脂酶的反膠團(tuán)，實(shí)現(xiàn)了對生物產(chǎn)品的部分分離。含有磷酯酶的發(fā)酵液經(jīng)過泵進(jìn)入到陶瓷超濾膜組件中，磷酯酶被截留在膜內(nèi)，萃余相則返回到反應(yīng)器，從而實(shí)現(xiàn)磷酯酶的分離。（2）中空纖維膜

中空纖維管是另一類被廣泛用于液-液分離的膜萃取器。它具有很大的比表面積，且與反膠團(tuán)技術(shù)相結(jié)合能減少蛋白質(zhì)的失活，是一項(xiàng)很有實(shí)用前景的生物分離技術(shù)。將親和配基（活性色素辛巴藍(lán)）加入到大豆卵磷酯-正已烷系統(tǒng)中，制成親和反膠團(tuán)相，并將此膠團(tuán)相固定于聚丙烯中空纖維膜內(nèi)，從而構(gòu)建起親和反膠團(tuán)萃取膜的分配色譜裝置（AMPC）。

2、離心萃取器

反膠團(tuán)溶液-水-蛋白質(zhì)所組成的萃取體系，由于表面活性劑的存在，界面張力低，易乳化。另外，由于萃取的目標(biāo)產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，易變性失活。為了盡量避免蛋白質(zhì)的變性，應(yīng)盡量縮短操作時(shí)間，因而反膠團(tuán)離心萃取是一項(xiàng)很合適的蛋白質(zhì)萃取分離技術(shù)。

3、混合澄清槽

混合-澄清式萃取器是一種最常用的液-液萃取設(shè)備，該設(shè)備由料液與萃取劑的混合器和用于兩相分離的澄清器組成，可進(jìn)行間歇或連續(xù)的液-液萃取。但該設(shè)備最大的缺點(diǎn)是反膠團(tuán)相與水相相混合時(shí)，混合液易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，從而增加了相分離時(shí)間。

4、微分萃取設(shè)備

（1）噴淋塔萃取器

噴淋塔是一種應(yīng)用廣泛的液-液微分萃取設(shè)備，具有結(jié)構(gòu)簡單和操作彈性大等優(yōu)點(diǎn)，在反膠團(tuán)萃取方面受到了人們的關(guān)注。尤為重要的是，當(dāng)用于含有表面活性劑的反膠團(tuán)體系時(shí)，所需輸入的能量很低，故不易乳化，從而縮短了相分離時(shí)間。但噴淋塔的缺點(diǎn)是連續(xù)相易出現(xiàn)軸向反混，從而降低萃取效率。（2）轉(zhuǎn)盤萃取塔

轉(zhuǎn)盤萃取塔（RDC）可用于蛋白質(zhì)的萃取分離。下圖是RDC萃取蛋白質(zhì)的示意圖，反膠團(tuán)相為分散相，水相為連續(xù)相。轉(zhuǎn)盤塔的優(yōu)點(diǎn)是單位塔高的效率高、高產(chǎn)量、操作彈性大和低能耗等。缺點(diǎn)是體系易出現(xiàn)乳化和返混現(xiàn)象。研究轉(zhuǎn)盤萃取塔中蛋白質(zhì)的反膠團(tuán)萃?。?）考察d32（反膠團(tuán)分散相中液滴直徑）的分布。d32隨著反膠團(tuán)特性的改變而改變。有溶菌酶存在時(shí)的d32比沒有時(shí)要小的多。另外，溶菌酶的溶解和傳質(zhì)也會影響反膠團(tuán)液滴的直徑；隨轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速的增大，液滴直徑也會下降。

（2）研究轉(zhuǎn)盤萃取塔中反膠團(tuán)萃取溶菌酶的傳質(zhì)性能，所建立的軸向擴(kuò)散模型可描述轉(zhuǎn)盤萃取塔的萃取性能，可用于轉(zhuǎn)盤萃取塔反膠團(tuán)萃取的參數(shù)預(yù)測和指導(dǎo)過程設(shè)計(jì)。第二節(jié)雙水相萃取掌握：1.聚合物的不相容性；相圖。2.雙水相體系的是的形成及組成3.影響雙水相萃取的因素4.雙水相萃取技術(shù)有什么優(yōu)越性利用物質(zhì)在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異來進(jìn)行萃取的方法。雙水相萃??？

雙水相的形成將兩種不同的水溶性聚合物的水溶液混合時(shí)，當(dāng)聚合物濃度達(dá)到一定值，體系會自然的分成互不相溶的兩相，這就是雙水相體系。這種含有不同聚合物分子的溶液發(fā)生分相的現(xiàn)象叫聚合物的不相容性。形成原因：由于高聚物之間的不相溶性，即高聚物分子的空間阻礙作用，相互無法滲透，不能形成均一相，從而具有分離傾向，在一定條件下即可分為二相。常用的雙水相體系

高聚物/高聚物體系：聚乙二醇(簡稱PEG)/葡聚糖(簡稱Dextran)高聚物/無機(jī)鹽體系：硫酸鹽體系。常見的高聚物/無機(jī)鹽體系為:PEG/硫酸鹽或磷酸鹽體系。雙水相系統(tǒng)(aqueoustwo-phasesystem,ATPS)

PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸鉀DX=葡聚糖(dextran)雙水相萃取的原理是生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配，當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種作用力（如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等）的存在和環(huán)境的影響，使其在上、下相中的濃度不同，即分配系數(shù)不同。第一節(jié)雙水相分離理論雙節(jié)線：把均相區(qū)和兩相區(qū)域分隔開。

系線：連接雙節(jié)線上兩點(diǎn)的直線。

均相區(qū)兩相區(qū)在同一條系線上的各點(diǎn)分成的兩相具有相同的組成，但體積比不同臨界點(diǎn)：當(dāng)系線長度趨向于零時(shí)，即在圖中的C點(diǎn)，兩相差別消失，任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1，成為單相體系。ATPS相圖雙節(jié)線(bi-nodal)：

圖中的曲線。雙節(jié)線以下的區(qū)域?yàn)榫鄥^(qū),以上的區(qū)域?yàn)閮上鄥^(qū)，即ATPS。

系線(tieline)：

雙節(jié)線上兩點(diǎn)的直線。系線反映的信息A杠桿規(guī)則：系線上各點(diǎn)均為分成組成相同，而體積不同的兩相。兩相體積近似服從杠桿規(guī)則B性質(zhì)差異：系線的長度是衡量兩相間相對差別的尺度,系線越長,兩相間的性質(zhì)差別越大；反之則越小.C 臨界點(diǎn)(criticalpoint)：當(dāng)系線長度趨于零時(shí),兩相差別消失,任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1。如K點(diǎn)。

對于PEG/Dextran所形成的雙水相體系中，若降低PEG相對分子質(zhì)量，則生物分子分配于富含PEG的上相中，使分配系數(shù)增大；而降低Dextran相對分子質(zhì)量，則分配系數(shù)減小。若想在上相獲得較高的蛋白質(zhì)收率，對于PEG聚合物，應(yīng)降低它的平均分子量，相反，若想在下相獲得較高的蛋白質(zhì)收率，則平均分子量應(yīng)增加。(1)成相聚合物的影響A、成相聚合物分子量B、成相聚合物的濃度聚合物分相的最低濃度為臨界點(diǎn)，系線的長度為零，此時(shí)分配系數(shù)為1，即組分均勻的分配于上下相.隨著成相聚合物的總濃度或聚合物/鹽混合物的總濃度增大，系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)，系線長度增加，兩相性質(zhì)的差別(疏水性等)增大，蛋白質(zhì)分子的分配系數(shù)將偏離臨界點(diǎn)處的值(m=1)，即大于1或小于1。因此,成相物質(zhì)的總濃度越高，系線越長，蛋白質(zhì)越容易分配于其中的某一相。(2)鹽的種類和濃度鹽的種類和濃度對分配系數(shù)的影響主要反映在對相間電位和蛋白質(zhì)疏水性的影響。①鹽的種類

在雙聚合物系統(tǒng)中，無機(jī)離子具有各自的分配系數(shù)，不同電解質(zhì)的正負(fù)離子的分配系數(shù)不同，從而產(chǎn)生不同的相間電位。由于各相要保持電中性，使得帶電生物大分子，如蛋白質(zhì)和核酸等分別向兩相移動分配。②鹽的濃度

鹽的濃度不僅影響蛋白質(zhì)的表面疏水性，而且擾亂雙水相系統(tǒng)，改變各相中成相物質(zhì)的組成和相體積比。例如，PEG/磷酸鹽體系中上下相的PEG和磷酸鹽濃度及Cl-在上下相中的分配平衡隨添加NaCl濃度的增大而改變，這種相組成即相性質(zhì)的改變直接影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)，如圖。離子強(qiáng)度對不同蛋白質(zhì)的影響程度不同，利用這一特點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)雙水相系統(tǒng)的鹽濃度，可有效地萃取分離不同的蛋白質(zhì)。（4）溫度的影響

分配系數(shù)對溫度的變化不敏感成相聚合物對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定化作用,所以室溫操作活性收率依然很高,而且室溫時(shí)粘度較冷卻時(shí)(4℃)低,有助于相的分離并節(jié)省了能源開支。（一）目的物的萃取1、如果目標(biāo)產(chǎn)物在上相中的分配系數(shù)足夠大，則細(xì)胞勻漿液中的目標(biāo)產(chǎn)物可采用一步或兩步雙水相萃取工藝獲得較高的純化倍數(shù)。一步雙水相萃?。菏前焉锊牧蠎腋∫汉碗p水相系統(tǒng)混合后，其中下相含