LED光源照射對人皮膚成纖維細胞的影響

LED光源照射對人皮膚成纖維細胞的影響胡曉劍;陳澤慶;周小麗;劉木清LED性強、操作簡單等優(yōu)勢,可以作為光源用于醫(yī)療領域.人成纖維細胞是皮膚的重要組LEDLEDLEDLED【期刊名稱】《照明工程學報》【年(卷),期】2019(030)003【總頁數(shù)】7頁(P61-66,74)【關鍵詞】發(fā)光二極管;人皮膚成纖維細胞;光生物調節(jié);光療【作者】胡曉劍;陳澤慶;周小麗;劉木清【作者單位】復旦大學光源與照明工程系,上海200433;先進照明技術教育部工程研究中心,上海200433;復旦大學光源與照明工程系,上海200433;先進照明技術教育部工程研究中心,上海200433;復旦大學光源與照明工程系,上海200433;先進照明技術教育部工程研究中心,上海200433;復旦大學光源與照明工程系,上海200433;先進照明技術教育部工程研究中心,上海200433【正文語種】中文【中圖分類】TM923.59引言光療是利用光線的輻射能治療疾病的一種理療法。自人工光源被發(fā)明以來，光療在實現(xiàn)傷口愈合、殺菌治療等作用[1-3]。光療難以廣泛應用的原因，一是人體內部的疾病難以引入光療手段，二是由于在細胞生長的條件中光照并非必要條件，因此理論依據(jù)不足。皮膚作為人體面積最大的器官，長期暴露在光照環(huán)境下，皮膚細胞的生長會受到不同光照條件的影響。因此，研究光照對皮膚細胞的影響具有重要的意義。此在使用上受到很多的限制[45]。LEDLED1實驗準備人皮膚成纖維細胞。成纖維細胞是疏松結締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質細胞分化而來，細胞活動旺盛，具備明顯的蛋白質合成和分泌作用，在一定壞死和組織缺損、創(chuàng)傷的修復具有重要的作用。人皮膚成纖維細胞是皮膚真皮的主要組成部分，其可合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維、透明質酸等細胞外基質，對于保持皮膚強度和彈性、修復損傷及美容美體具有重要作用，是維持皮膚年輕態(tài)的決定性因素，也是維持皮膚結構穩(wěn)定的重要組成部分[67]。380～780nm380～780nm5波長LED作為照射光源，對培養(yǎng)在96孔細胞培養(yǎng)板中的人皮膚成纖維細胞進行照射，測定光照后的細胞活性，探究光照對人皮膚成纖維細胞的影響。通過設計以ZXLD1370LED143WLEDZXLD1370LED11ZXLD1370LEDFig.1LEDdrivercircuitbasedonZXLD1370driver在ZXLD1370芯片的引腳中，V+與V-引腳用于接收外界的電源信號，為控制電路和發(fā)光電路提供電源。FB與SENSE引腳之間通過電子元器件構成一個內部電路，通過元器件的不同參數(shù)選擇改變輸出恒流的大小。LED+與LED-引腳用于連接LEDADJThorlabsPM100DS170C20mW/cm25LEDSPIC-2000LED1表1實驗用LED的波長Table1WavelengthsofLEDsusedinexperimentsLEDLED1LED2LED3LED4LED5峰值波長/nm384418457526630由于細胞的培養(yǎng)過程中需要穩(wěn)定的溫濕度、CO2濃度和無菌的環(huán)境，因此細胞在培養(yǎng)過程中都是放置于細胞培養(yǎng)箱中生長的。細胞培養(yǎng)過程中同時施加以上的光照條件。細胞培養(yǎng)。取液氮凍存中的人皮膚成纖維細胞，按細胞復蘇的標準流程操作，于37℃溫水中迅速解凍后，離心棄去上清液，加入含10%FBS，1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)在25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，于5%CO2、37℃、95%相對濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并日常觀察細胞狀態(tài)。待到顯微鏡下觀察視野范圍內細胞達到80%匯合程度時，即可進行傳代培養(yǎng)。細胞傳代培養(yǎng)時，使用0.25%Trypsin-EDTA將細胞從培養(yǎng)瓶中消化至脫落，轉移到離心管中以1000R的轉速離心5min10%FBS，1DMEM25cm296[1314]。KXN-645DFY2300-02MThorlabsPM100DThorlabsS170CCKX53HealForceAlphaClean1300RJ-TGL-1600R803MultiScanHyCloneDMEMGibcoFBS(烏拉圭來源)、HyClonePBS、Gibco0.25Trypsin-EDTA、GibcoPenicillinStreptomycin。2生長曲線實驗細胞的生長速度并不是固定的，而是隨著培養(yǎng)條件、細胞數(shù)目、細胞狀況等一系列條件發(fā)生變化。細胞的生長分為潛伏期、生長期、平臺期和衰退期。其中潛伏期細胞生長緩慢，平臺期細胞接近停止生長，衰退期細胞開始凋亡，而生長期的細胞生長狀況旺盛，適合用于實驗。因此在光照試驗前，需要先測定細胞的生長曲線，確定細胞的生長期，以便于之后的實驗選擇生長期的細胞進行光照試驗。細胞的生長曲線一般有兩種測定方法，一種是細胞計數(shù)法，另一種是CCK-8法。由于細胞計數(shù)法誤差較大，因此一般用于簡單觀測生長趨勢，我們采用更加精確的CCK-8法進行生長曲線測定[15]。采用CCK-8法測定生長曲線時，將細胞以每孔1000個的數(shù)量接種到96孔板中，540.1mL60.1mL不含細胞的培養(yǎng)基，作為對照。處理完成后，將96孔板放入細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。24h后取出96孔板，向其中6個孔加入1單位CCK-8試劑，充分混勻后重新放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h，之后取出并在酶標儀上讀取位于450nm處的吸光度值(opticaldensityOD24h68d96孔板如圖2所示，測得的數(shù)據(jù)如表2所示。在數(shù)據(jù)處理時，為了減小誤差，去掉一個最高和一個最低值，對數(shù)據(jù)進行處理得到相對細胞活性如表3所示。圖2實驗用96孔細胞培養(yǎng)板Fig.296-wellcellcultureplateusedinexperiments2Table2ODofexperimentsforcellcurveofgrowth250.2220.4530.4410.3410.6000.9591.1821.4261.5911.8010.2210.4720.410.4100.5491.0351.2021.4691.5061.8030.2070.2980.4130.4800.6530.9011.1471.4511.4611.7930.2130.3520.3250.4250.6101.0611.1941.5641.8131.6253Table3Relativeviabilityrateofexperimentsforcellcurveofgrowth0.9951.1901.1902.3454.5275.8838.0719.0089.646—1.4511.2081.6162.6674.9896.0057.6288.3699.597—0.8370.6731.2812.4065.1475.9567.5187.8538.576根據(jù)數(shù)據(jù)作折線圖得到細胞生長曲線，如圖3所示?？梢钥闯觯似つw成纖維細胞在1～2天處于潛伏期，生長較為緩慢，從第3天開始生長速度明顯加快，一直到第6天都能保持快速增長，而從第7天開始進入平臺期，增長速度明顯下降，在8天的測試中沒有觀測到明顯的衰退期，推測衰退期應該在第9天及以后出現(xiàn)。因此可以總結出人皮膚成纖維細胞的生長期為3～6天，由此得出應取傳代后3～6天的細胞進行光照實驗。圖3人皮膚成纖維細胞細胞生長曲線Fig.3Cellcurveofgrowthforhumanfibroblasts光照實驗不同波長光照實驗取培養(yǎng)瓶中80%匯合的細胞進行接種操作，準備6個96孔板，每個六孔板接種61000A660.1mLCCK-8963d表4所示。表4不同波長光照實驗設置的光照參數(shù)Table4Experimentalparametersofeachgroupfordifferentwavelengthtest分組波長/nm光強/(mW/cm2)光照時間/minA———B3842030C4182030D4572030E5262930F6302030表4中A為對照組，不進行光照，B～F為實驗組，保持光照強度相同，時間相同，進行不同波長的光照。實驗步驟如下：CO210min有衰減；9630min；9624h；961CCK-8養(yǎng)1h；96450nmOD不同時長光照實驗選擇波長為630nm的紅光LED8069661000A660.1mLCCK-8963d表5所示。表5不同時長光照實驗設置的光照參數(shù)Table5Experimentalparametersofeachgroupfordifferentradiationlengthtest分組波長/nm光強/(mW/cm2)光照時間/minA———B630205C6302015D6302030E6302060F63020120表5中A為對照組，不進行光照，B～F為實驗組，保持波長相同，光照強度相同，進行不同時間長度的光照。實驗步驟如下：CO210min有衰減；969624h；961CCK-8h；96450nmOD得出細胞活性的數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)及分析實驗數(shù)據(jù)不同波長光照實驗中，用酶標儀測得的數(shù)據(jù)如表6所示。在不同時長光照實驗中，用酶標儀測得的數(shù)據(jù)如表7所示。表6不同波長光照實驗的樣品吸光度Table6ODofexperimentsfordifferentwavelengthtest分組吸光度A-無細胞0.1920.2040.2060.2080.2070.210A-有細胞0.4880.5650.5340.5490.4250.493B0.2460.2570.2600.2480.2380.232C0.3710.3710.3950.3810.3810.364D0.5020.4690.5180.4700.5150.499E0.5080.5630.5670.5850.5880.547F0.6110.6310.5980.6090.5920.560表7不同時長光照實驗的樣品吸光度Table7ODofexperimentsfordifferentradiationlengthtest分組吸光度A-無細胞0.1920.2040.2060.2080.2070.210A-有細胞0.4880.5650.5340.5490.4250.493B0.5180.5200.5870.5060.5290.504C0.5270.5500.5640.6110.5680.572D0.6110.6310.5980.6090.5920.560E0.6250.5980.6320.6530.5180.584F0.5920.6040.6620.5940.6330.598數(shù)據(jù)處理及分析實驗中采用CCK-8法測定細胞的活性[16]。CCK-8法是用于測定細胞增殖或毒性實驗中活細胞數(shù)目的一種高靈敏度，無放射性的閉塞檢測法。CCK-8利用了Dojindo開發(fā)的水溶性四唑鹽—WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽),它在電子載體1-MethoxyPMS存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲臜染料。WST-8被細胞內脫氫酶氧化還原后生成橙黃色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量與活細胞的數(shù)量成正比。由于使用酶標儀檢測，獲得的數(shù)據(jù)為吸光度，計算公式為：(1)ηAsCCK-8)數(shù)據(jù)，AcCCK-8)數(shù)據(jù),Ab實驗中的所有數(shù)據(jù)均使用GraphPadPrism7.0軟件進行分析和作圖。不同波長對人皮膚成纖維細胞影響的分析首先將酶標儀測得的吸光度數(shù)據(jù)按照計算公式轉換為相對細胞活性的數(shù)據(jù)，在數(shù)據(jù)處理時，為了減小誤差，去掉一個最高值和一個最低值，對數(shù)據(jù)進行處理得到相對細胞活性。處理后的數(shù)據(jù)如表8所示。表8不同波長光照實驗的相對細胞活性Table8Relativeviabilityrateofdifferentwavelengthtest分組相對細胞活性A0.9101.0581.1070.926B0.1280.1630.1350.103C0.5320.5320.5640.564D0.9550.9350.9970.945E1.1521.1651.2231.100F1.3071.2651.3001.245根據(jù)表格繪柱狀圖，x坐標為不同波長的實驗組，其中Ctr表示無光照的對照組，y坐標為相對細胞活性，如圖4所示。圖4不同波長光照對細胞的影響Fig.4Cellproliferationunderdifferentwavelengthtest4LED384nm、418nm、457nm384nm457nm526nm630nmnm630nm胞活性增強更為明顯。不同的效果為我們的應用提供了多方位的選擇。例如在選擇去除增生組織的要求中，我們可以選擇384nm波長的LED光源，使多余的人皮膚成纖維細胞生長受到抑制；而在皺紋修復的要求中，我們可以選擇630nm波長的LED光源，使局部的人皮膚成纖維細胞活性增加，從而更快生長填滿皮膚溝壑，達到修復的目的。不同時長對人皮膚成纖維細胞影響的分析首先將酶標儀測得的吸光度數(shù)據(jù)按照計算公式轉換為相對細胞活性的數(shù)據(jù)，在數(shù)據(jù)處理時，為了減小誤差，去掉一個最高和一個最低值，對數(shù)據(jù)進行處理得到相對細胞活性。處理后的數(shù)據(jù)如表9所示。表9不同時長光照實驗的相對細胞活性Table9Relativeviabilityratefordifferentradiationlengthtest分組相對細胞活性A0.9101.0581.1070.926B1.0061.0130.9681.042C1.1101.1551.1681.181D1.3071.2651.3001.245E1.3521.2651.3741.220F1.2841.2521.3871.265根據(jù)表9繪制折線圖，x坐標為不同照射時長，其中對照組由于無光照，因此可以視為照射時長為0，y坐標為相對細胞活性，如圖5所示。圖5不同時長光照對細胞的影響Fig.5Cellproliferationunderdifferentradiationlengthtest從圖5可以看出，隨著照射時長的增加，細胞活性變強，但細胞活性增強的趨勢逐漸平緩。在光照時間小于30min時，細胞活性隨光照時間增加有較為明顯的提升，而在光照時間超過30min之后，細胞活性的水平趨于穩(wěn)定。從實際治療的角度來看，對一個患病部位進行過長時間的照射會導致病人的體驗不佳，且無法獲得更加顯著的效果。因此本文認為，在光功率密度為20mW/cm2的情況下，采取30min的照射時長是比較合適的治療方案。結論我們通過實驗驗證了LED對人皮膚成纖維細胞具有一定的影響，實驗的數(shù)據(jù)表明，LEDnm、417nm457nm526nm630nm384nm630nm630nm20mW/cm230min后續(xù)的研究中，可以著重探討的問題還有不同光強對于人皮膚成纖維細胞的影響等。本文的研究僅針對LED對體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞的影響得出初步結論，至于LED對人皮膚的影響效果是否與體外實驗一致，還需進一步的研究。參考文獻【相關文獻】LED[J]2013，2419-21.CAETANOKS,FRADEMAC,MINATELDG,etal.PhototherapyImprovesHealingofChronicVenousUlcers.PhotomedicineandLaserSurgery[J].2009，27(1):111-118.deFreitasLF,HAMBLINMR.ProposedMechanismsofPhotobiomodulationorLow-LevelLightTherapy[J].IEEEJournalofSelectedTopicsinQuantumElectronics,2016,22(3):348-364.LED[J]2016,27(3)131-137.劉江,角建瓴，劉承宜，等.LED[J]2002(6)1-4.AUSTINE,HUANGA,ADART，etal,Electronicdevicegeneratedlightincreasesreactiveoxygenspeciesinhumanfibroblasts[J].LasersSurgMed,2018:689-695.趙娟，石艷，孫波，等.人皮膚成纖維細胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定[J]899-902.DECARVALHOFB,ANDRADEAS,RASQUINLC,etal.Effectoflaser(λ660nm)andLED(λ630nm)phot