RNAi技術(shù)在作物品質(zhì)改良中的應(yīng)用

RNAi技術(shù)在作物品質(zhì)改良中的應(yīng)用延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳國(guó)梁瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院2006年10月2日宣布，將2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予美國(guó)科學(xué)家安德魯·法爾和克雷格·梅洛，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了RNA(核糖核酸)干擾（interference

）機(jī)制。

AndrewZ.FireCraigC.MelloFire生于1959年，現(xiàn)在是美國(guó)斯坦福大學(xué)遺傳學(xué)和病理學(xué)教授。Mello出生1960年目前在美國(guó)馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院任教。1998年，他們?cè)凇蹲匀弧冯s志上共同發(fā)表論文宣布，他們發(fā)現(xiàn)了RNA具有可以干擾基因的機(jī)制。Mello在家中接到諾貝爾獎(jiǎng)評(píng)審委員會(huì)電話的時(shí)是當(dāng)?shù)貢r(shí)間4時(shí)40分左右。他感到“非常驚訝”，“到現(xiàn)在還沒(méi)回過(guò)神來(lái)”。他說(shuō)：“我有預(yù)感可能得獎(jiǎng)，但我才45歲啊，原本以為10年或20年后才會(huì)得獎(jiǎng)呢。”Fire在接受媒體采訪時(shí)則說(shuō)，獲獎(jiǎng)的感覺(jué)真是非常美妙，“一開(kāi)始，我都不敢相信，它也許是個(gè)夢(mèng)，或者有人搞錯(cuò)了，但又想這不可能。能獲獎(jiǎng)?wù)媸翘袅?！”《Science》周刊2001，2002，2003，2004年連續(xù)四年將“非編碼RNA”等評(píng)選為該年度全球科學(xué)十大進(jìn)展，而2002年更將其作為進(jìn)展的第一位。然而，更加令人吃驚和興奮的是，4年后，這項(xiàng)技術(shù)的始作俑者，F(xiàn)ire和

Mello就因此獲得2006年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。在評(píng)審委員會(huì)的公報(bào)中稱：“他們的發(fā)現(xiàn)澄清了許多令人迷惑和矛盾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，揭開(kāi)了大自然控制遺傳信息流動(dòng)的一種機(jī)制，他們開(kāi)創(chuàng)了一個(gè)嶄新的研究領(lǐng)域”；“像在清晨突然打開(kāi)窗簾，然后一切都一目了然了”。這些都表明小RNA的研究已引起國(guó)際上的廣泛關(guān)注，并且引領(lǐng)著生命及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域前沿課題的研究。小RNA的出現(xiàn)以及RNA干涉現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)重新喚起了科學(xué)家們對(duì)“RNA世界”的重視及對(duì)“生命起源于RNA分子”這一命題的興趣。那么，什么是RNA干擾？反義RNA技術(shù)：指利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建人工表達(dá)載體，使其體外或體內(nèi)表達(dá)反義RNA，從而抑制靶基因的表達(dá)。①與前mRNA結(jié)合，影響mRNA的成熟和在胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)；②與相應(yīng)的靶RNA結(jié)合從而激活RNase,加速靶RNA的降解；③直接與起始密碼子AUG結(jié)合而阻止轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)；④互補(bǔ)作用于SD編碼區(qū)的反義RNA可阻止核糖體在mRNA上的移動(dòng)。蛋白質(zhì)mRNADNA1RNAi是如何發(fā)現(xiàn)的？1.1加深矮牽牛花的紫色

1990，Jorgensenetal；材料：牽?；?；目的：得到紫色更深的花；方法：構(gòu)建由強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)的查耳酮合酶基因表達(dá)載體，導(dǎo)入牽?；?；結(jié)果：雜色花或花變得更白；分析：內(nèi)源和外源的查耳酮合酶基因的表達(dá)都被抑制。稱之為共抑制（co-suppression）。1.2

提高紅面包霉菌的橘色色素含量90年代中期；材料：紅面包霉菌；目的：提高紅面包霉菌的橘色色素含量；方法：額外轉(zhuǎn)入與類胡蘿卜色素生產(chǎn)相關(guān)之基因，提高該基因內(nèi)生存在之拷貝數(shù)；結(jié)果：卻發(fā)現(xiàn)大約有三分之一的霉菌無(wú)法產(chǎn)生色素，呈現(xiàn)白色，而不是深橘色；分析：內(nèi)源和外源的基因的表達(dá)都被抑制。1.3阻斷秀麗新小桿線蟲(chóng)的par-1基因

1995，GuoSuetal材料：線蟲(chóng)；目的：消除線蟲(chóng)第一次分裂的不對(duì)稱性；方法：利用反義技術(shù)抑制par-l的表達(dá)。同時(shí)也注入正義RNA以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)；結(jié)果：兩種方法都抑制par-l基因；分析：這是與當(dāng)時(shí)理論相矛盾，無(wú)法解釋，該研究小組一直沒(méi)能給這個(gè)意外以合理解釋；1.4阻斷秀麗新小桿線蟲(chóng)的par-1基因

1998，F(xiàn)ireetal材料：線蟲(chóng)；目的：消除線蟲(chóng)第一次分裂的不對(duì)稱性；

方法：注射經(jīng)過(guò)純化的由T4和T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄得到的ss-RNA；注射經(jīng)過(guò)純化后的dsRNA；結(jié)果：ss-RNA只引起微弱的抑制作用；dsRNA卻得到比前者高兩個(gè)數(shù)量級(jí)的抑制效果；分析：RNAInterference(RNAi)，Nature，1998，391:806-811；2

RNAi現(xiàn)象的普遍性在隨后的短短一年中，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲(chóng)、錐蟲(chóng)、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中。這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進(jìn)化的早期階段。隨著研究的不斷深入，RNAi的機(jī)制正在被逐步闡明，而同時(shí)作為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具，RNAi也越來(lái)越為人們所重視。

3什么是RNAiRNA干擾（RNAinterference，RNAi），或稱RNA干涉，是由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA引起的序列特異性基因沉默。小分子雙鏈RNA能對(duì)基因的表達(dá)的不同層次進(jìn)行調(diào)控，即轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（主要體現(xiàn)在siRNA修飾DNA分子，抑制轉(zhuǎn)錄的發(fā)生）和轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默（主要指siRNA在mRNA水平抑制目標(biāo)基因表達(dá)），來(lái)調(diào)節(jié)或關(guān)閉基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級(jí)生命活動(dòng)。4RNAi作用過(guò)程（1）起始步驟

dsRNA的形成dsRNA切成siRNARNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）的形成（2）作用步驟

RISC中的siRNA可與序列互補(bǔ)的特定mRNA識(shí)別，之后，mRNA與dsRNA的一條鏈發(fā)生鏈互換，從酶-dsRNA復(fù)合物中釋放出來(lái)。核酸酶在同樣位置對(duì)mRNA進(jìn)行切割，這樣又產(chǎn)生了21～23bp長(zhǎng)的dsRNA小片段，與核酸酶形成復(fù)合物，繼續(xù)對(duì)目的mRNA進(jìn)行切割，達(dá)到抑制表現(xiàn)的效果。5RNAi的作用類型

針對(duì)DNA分子在轉(zhuǎn)錄水平

針對(duì)mRNA在轉(zhuǎn)錄后水平RNA介導(dǎo)DNA的甲基化

RNA介導(dǎo)的異染色質(zhì)形成RNA介導(dǎo)的DNA分子消融siRNA在mRNA水平抑制目標(biāo)基因表達(dá)普遍性

高效性特異性

可傳播性

擴(kuò)散性

位置效應(yīng)

RNAi的特點(diǎn)6RNAi的特點(diǎn)7RNAi技術(shù)在作物品質(zhì)改良中的應(yīng)用

7.1利用RNAi調(diào)控某一物質(zhì)含量以提高作物品質(zhì)高油酸油有其重要意義:一是高油酸菜油是一種健康營(yíng)養(yǎng)油，可降低人體動(dòng)脈血管中低密度脂蛋白的含量，而對(duì)高密度脂蛋白含量則沒(méi)有影響，從而減少膽固醇的形成，有效預(yù)防人體心血管疾??；二是高油酸菜油較耐貯藏，貨架期較長(zhǎng)；三是高油酸菜油能有效進(jìn)行甲酯化，有利于生產(chǎn)生物柴油。因此，利用轉(zhuǎn)錄后水平的RNA干擾技術(shù)同時(shí)抑制這兩個(gè)酶基因的表達(dá)，希望通過(guò)這種方式提高油料作物的油酸和芥酸的含量，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。油酸油酸脫氫酶（FAD2）亞油酸油酸脂肪酸延長(zhǎng)酶(FAE1)芥酸利用RNAi沉默技術(shù)抑制油菜油酸脫氫酶（FAD2）使甘藍(lán)型油菜和芥菜型油菜中的油酸含量分別升高到89%和75%棉花的FAD2將棉花籽油中硬脂酸含量從非轉(zhuǎn)基因的2%～3%提高到40%，油酸含量從15%提高到77%。7.2改良淀粉品質(zhì)

淀粉是重要的工業(yè)原料，但是生產(chǎn)不同產(chǎn)品所需淀粉種類有所差別，如何針對(duì)工業(yè)生產(chǎn)所需來(lái)提高作物某一類淀粉的含量以降低原料純化的成本，而利用RNAi技術(shù)改變代謝的物質(zhì)流方向，來(lái)提高工業(yè)加工原料在作物中的含量，無(wú)疑是一種十分有效的方法。利用RNAi技術(shù)抑制得到總淀粉含量與對(duì)照之間基本沒(méi)有差異，但直鏈淀粉的含量提高了約50%的轉(zhuǎn)基因玉米植株培育出低直鏈淀粉含量的轉(zhuǎn)基因紅薯個(gè)體;獲得了直鏈淀粉含量明顯下降的小麥植株;玉米淀粉分支酶(SBE)直鏈淀粉合成的關(guān)鍵酶(Waxy基因)籽粒直鏈淀粉含量提高到70%以上小麥SBEⅡa

和SBEⅡb基因7.3提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)植物產(chǎn)品為人們的生產(chǎn)生活提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)，然而一些作物中的某些物質(zhì)對(duì)人類的健康有害或?qū)δ承┤巳河胁涣挤磻?yīng)，有些又是有利于人類健康。于是人們開(kāi)始利用RNAi技術(shù)提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或降低有害物質(zhì)含量研究，為人類提供更健康、更個(gè)性化的產(chǎn)品。番茄DET1基因番茄紅素B2環(huán)化酶（Lcy）基因利用RNAi技術(shù)抑制提高了番茄類胡蘿卜素和黃酮醇這兩種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，而果實(shí)的其它營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)卻沒(méi)有很大改變。轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的番茄紅素測(cè)定都比非轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中番茄紅素高，平均增加了2.8倍。轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中β-胡蘿卜素的含量增加了14倍，類胡蘿卜素總量增加了2.5倍。Lye-ε環(huán)化酶7.4降低有害物質(zhì)含量利用RNAi沉默技術(shù)抑制亞麻苦苷和百脈根苷合成途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶的表達(dá)得到的轉(zhuǎn)基因木薯塊莖中含氰苷含量降低92％、葉片中氰苷含量低于野生型氰含量的1％，極大改善了木薯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。轉(zhuǎn)基因植物中可可堿含量下降了30%-80%，咖啡因含量下降50%-70%，這將使咖啡因?qū)γ舾腥巳旱拇碳そ档?，使引發(fā)心悸、高血壓、失眠等癥減少?？Х戎参镏芯幋a可可堿合成酶基因的表達(dá)棉花分部廣泛，是紡織業(yè)主要纖維來(lái)源。也是亞非二千萬(wàn)農(nóng)民重要經(jīng)濟(jì)作物。獲得1公斤纖維的同時(shí)，產(chǎn)生1.65公斤含有高質(zhì)量蛋白的棉籽。然而，棉籽一直未能充分利用，原因在于其體內(nèi)的毒性分子——棉酚。棉酚貫穿于棉樹(shù)的莖、葉等各種組織，以抵御昆蟲(chóng)、病毒對(duì)棉樹(shù)的攻擊，只有反芻動(dòng)物能夠以棉株為食。因此有人設(shè)想在維持棉樹(shù)高產(chǎn)棉纖維的同時(shí)，開(kāi)發(fā)棉樹(shù)蛋白，滿足數(shù)百萬(wàn)人的蛋白需求。2006年，Ganesan等通過(guò)RNAi技術(shù)抑制了棉籽中棉酚合成途經(jīng)中δ-杜松烯合成基因的表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株與野生型棉籽相比棉酚含量降低了99％，而葉片及花中的帖類化合物沒(méi)有減少，其對(duì)病害及昆蟲(chóng)的抗性亦沒(méi)降低。7.5利用RNAi提高果實(shí)耐貯性采用基因工程技術(shù)提高果實(shí)耐貯性，主要是以SAM水解酶、ACC合成酶、ACC氧化酶、ACC脫氨酶等酶的基因?yàn)榘谢蚴蛊涑聊?，從而達(dá)到果實(shí)耐貯的目的。其中以ACC合成酶和ACC氧化酶基因研究較多。Xiong等構(gòu)建了含有ACC氧化酶基因的序列的RNA干擾載體用于轉(zhuǎn)化番茄，結(jié)果有69%的轉(zhuǎn)化植株表現(xiàn)出100%的干擾效果，18%的植株表現(xiàn)出50%的干擾效果，果實(shí)從破色期到成熟期依次需要120d，30d，而對(duì)照只有5d。aFruitoftransgenicplanttomatoshowedfull-RNAi.bFruitofnontransgenicplantHezuo906.CChangesinthecolorsoftomatofruitsofcv.Hezuo906plantsfrombreaker+1daytobreaker+120days,semi-RNAiandfull-RNAitransgenicplantsofACCoxidase:afruitofthecontroltomatoplantchangedtoredatbreaker+5days,bsemi-RNAitransgenictomatofruitchangedtoredatbreaker+30days,cfull-RNAitransgenictomatofruitchangedfirsttobuffandthentoaweak-redcolorveryslowly;atbreaker+120days,thefruitwasrosyincolorabc陳銀華通過(guò)構(gòu)建了番茄ACO的RNA干涉載體，并獲得了大大抑制了內(nèi)源ACO基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株從而導(dǎo)致乙烯的生成大大降低?？捎糜诟牧挤训哪唾A性。柿果可見(jiàn)，利用RNAi技術(shù)調(diào)控果實(shí)成熟，具有里要的理論意義、巨大的經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用前景。利用RNAi技術(shù)抑制ACC氧化酶基因砂梨百合花椰菜延長(zhǎng)果品的貯藏期或延緩果品衰老，并取得了一定的進(jìn)展7.6利用RNAi提高抗褐化能力

多酚氧化酶（PPO）是植物、細(xì)菌和真菌等生物體內(nèi)普遍存在的一種酶，是農(nóng)產(chǎn)食品加工過(guò)程中產(chǎn)生酶促褐變的關(guān)鍵酶類。在果實(shí)和蔬菜收獲后或加工時(shí)，PPO所引起的反應(yīng)常常會(huì)使果肉發(fā)生褐變、產(chǎn)生異味和損失營(yíng)養(yǎng)，抑制PPO活性可以減弱褐變程度。應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制PPO活性控制了馬鈴薯的褐變獲得的轉(zhuǎn)基因蘋果植株內(nèi)PPO基因的干擾效果達(dá)91.69%以上，從而證實(shí)了PPO雙鏈RNA干擾在轉(zhuǎn)基因蘋果上是可行的。希望在不影響小麥的生長(zhǎng)、抗逆性的前提下，特異地抑制小麥籽粒中PPO合成，從而減弱面粉及其面食品在加工、貯藏中的褐變，提高面粉白度。7.7

利用RNAi進(jìn)行代謝調(diào)控

以獲得目的次生代謝物嗎啡可待因酮可待因酮與嗎啡共同的前體分子可待因酮還原酶基因家族2004年，Allen等成功應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制罌粟中可待因酮還原酶基因家族基因的表達(dá)，極大地提高罌粟中嗎啡的含量罌粟中的網(wǎng)狀番茄枝堿胡新玲等利用RNAi對(duì)14β－羥基化酶(14OH)基因表達(dá)進(jìn)行抑制后，可能阻斷中間產(chǎn)物流向C-14氧取代的紫杉烷，而走向紫杉醇等C-13氧取代的紫杉烷，從而大幅度地提高后者的產(chǎn)量。Dubouzet等在2005年報(bào)道了用RNAi技術(shù)抑制黃連中異喹啉生物合成途徑中金黃紫堇堿9-O甲基轉(zhuǎn)移酶基因，使該酶的表達(dá)水平明顯降低。7.8利用RNAi培育抗病蟲(chóng)害作物在天然狀態(tài)下，棉花為了保護(hù)自身免遭昆蟲(chóng)啃食，會(huì)分泌一種棉毒素，但這一招卻對(duì)棉鈴蟲(chóng)無(wú)效?！敖苹钡拿掴徬x(chóng)在進(jìn)化中，發(fā)展出了一套完善的解毒機(jī)制，能肆無(wú)忌憚地對(duì)棉花侵害，每年造成我國(guó)棉花生產(chǎn)數(shù)十億元的經(jīng)濟(jì)損失。在幫助