水解酶及氧化還原酶組織化學(xué)原理及方法

水解酶及氧化還原酶組織化學(xué)原理及方法水解酶

hydrolases指催化底物發(fā)生水解反應(yīng)的酶類例如:磷酸酶類、酯酶類等AB＋H2OAH＋BOH

酶磷酸酶類磷酸酶類是水解磷酸化合物的酶的總稱水解磷酸酯鍵，釋放磷酸離子，為重金屬捕獲而產(chǎn)生沉淀；或釋放萘酚而為重氮鹽耦聯(lián)而顯色。堿性磷酸酶：在pH9.2-9.4表現(xiàn)為最大活性酸性磷酸酶：在pH5.0顯示最大活性顯示法：金屬沉淀法偶氮耦聯(lián)法堿性磷酸酶

alkalinephosphatase,AKP、ALP在堿性范圍，催化各種醇和酚的磷酸酯水解。磷酸和R能用組化方法捕獲。鈣鈷法：捕獲磷酸偶氮耦聯(lián)法：當R為萘酚衍生物時，捕獲R二者最終均形成有色沉淀，可作定位觀察。激活：金屬離子—Mg2+、Mn2+、Zn2+、Co2+

抑制：Tetramisol(四咪唑)、各種醇類、L-半胱氨酸鈣鈷法（金屬沉淀技術(shù)）

Gomori-Takamatus法原理：把游離的磷酸變?yōu)辂}的形式從而產(chǎn)生沉淀β-甘油磷酸鈉（底物）─→磷酸離子磷酸離子+Ca2+─→磷酸鈣（不可見）磷酸鈣+Co2+─→磷酸鈷（不可見）磷酸鈷+S2-─→硫化鈷（不溶，可見）條件：pH9.4AKP作用液：2%巴比妥鈉3%β-甘油磷酸鈉2%無水氯化鈣2%MgSO4.7H2O步驟：新鮮恒冷箱切片，8μ不固定直接進作用液FCa（氯化鈣Formalin）固定5'-2h，4℃，固定后蒸餾水洗作用液10-60’，37℃（視組織而定）流水5’2%硝酸鈷5’蒸餾水洗1-2%硫化銨1’（*硫化銨需新鮮配制）蒸餾水洗甘油明膠封

結(jié)果：黑色的顆粒狀沉淀對照：去底物（以雙蒸水替代β-甘油磷酸鈉），結(jié)果陰性進作用液前用抑制劑抑制酶或?qū)⑶衅梅兴惺姑甘Щ钭⒁猓航M織內(nèi)含鐵血黃素與鈣鹽形成棕黑色沉淀，應(yīng)鑒別（鐵反應(yīng)）AKP主要存在于物質(zhì)交換活躍處：腸上皮和腎近曲小管的刷狀緣、肝毛細膽管膜以及微動脈和毛細血管動脈部的內(nèi)皮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、吞飲小泡腸上皮的溶酶體、中性粒細胞的中性顆粒，平滑肌細胞膜是細胞膜的標志酶之一骨肉瘤內(nèi)有豐富的AKP偶氮耦聯(lián)法原理：磷酸萘酯經(jīng)酶水解放出萘酚，立刻為重氮鹽捕獲而成為有色不溶的偶氮染料。

α-萘酚磷酸鈉α-萘酚

α-萘酚重氮鹽（固藍RR）偶氮染料Lojga改良Burstone偶氮耦聯(lián)法作用液萘酚AS-SI磷酸鈉DMSO(二甲基亞砜)六偶氮對品紅A液：鹽酸對品紅400mg，蒸餾水8ml，濃鹽酸(36%)2ml混合溶解過濾B液：4％亞硝酸鈉液臨用前A、B液等量混合Tris-HCl緩沖液（pH8.2~9.2）步驟：小塊組織用液氮驟冷，恒冷箱切片固定FCa5分鐘，4℃，固定后蒸餾水洗不固定作用液5-60’，37℃或室溫蒸餾水洗4%甲醛固定15’-2h，室溫自來水洗，蒸餾水洗1%甲基綠（氯仿洗過）5-10分鐘，蒸餾水洗（1）甘油明膠封（2）丙酮-丙酮甲苯-甲苯-DPX封結(jié)果：酶活動處出現(xiàn)紅色無定形的沉淀，核呈藍綠色，對比明顯*重氮鹽也可用固藍B鹽,這種酶的反應(yīng)活性部為紫黑色，核的對比染色應(yīng)改用核固紅或中性紅。鈣鈷法和偶氮耦聯(lián)法比較鈣鈷法操作簡單，但會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象偶氮耦聯(lián)法的保溫時間短，方法比較靈敏；在正常組織中無萘酚，不會出現(xiàn)假陽性，故不需對照切片；反應(yīng)產(chǎn)物為偶氮染料，較磷酸鈣更難溶解，定位好，不易擴散，圖象清晰，并可控制反應(yīng)深度酸性磷酸酶（ACP）

ACP是在酸性范圍里水解磷酸單酯，游離出磷酸的酶最適pH為4.5-5.5

ACPACPGomori鉛法作用原理同AKP。因磷酸鈣在酸性pH溶解，故用硝酸鉛作為捕獲劑，再用硫化氫直接把磷酸鉛轉(zhuǎn)變?yōu)榱蚧U，最后形成棕黑色硫化鉛沉淀。激活劑：Mn2＋抑制劑：氟化鈉、磷酸根離子對照：去底物；抑制酶作用液巴比妥醋酸緩沖液（PH5.0）20ml3%β-甘油磷酸鈉2ml硝酸鉛24mg用巴比妥醋酸緩沖液溶解硝酸鉛，然后再加入3%β-甘油磷酸鈉，徹底混合后過濾，再測定其PH值，如不足或高于，都應(yīng)調(diào)校至5.0。步驟恒冷箱冷凍切片，附貼于硅化載玻片上，電吹風(fēng)吹干30分鐘后，用純丙酮固定5-10分鐘。蒸餾水輕洗。將切片于作用液中孵育30-120分鐘（37℃）。蒸餾水沖洗1分鐘。1%冰醋酸水溶液浸洗30秒鐘。蒸餾水沖洗1分鐘。1%硫化銨水溶液處理1分鐘。流水沖洗后再入蒸餾水洗。核固紅染核5分鐘。流水洗5-10分鐘。常規(guī)脫水、透明并封固。結(jié)果：細胞核紅色，酸性磷酸酶活性部位呈棕黃至棕黑色。偶氮耦聯(lián)法作用原理同AKP。因為許多重氮鹽在pH5.0時，不能與α-萘酚偶聯(lián)；或在pH5.5時雖可偶聯(lián)，但水解的速度大于耦聯(lián)速度而造成彌散。而萘酚AS-BI磷酸鈉，與六偶氮對品紅偶聯(lián)，反應(yīng)產(chǎn)物不溶，可獲得正確的定位，鮮紅色沉淀表明酶活性的位置。經(jīng)氯仿提取過的甲基綠為理想的復(fù)染染料，選擇性地染胞核，而不影響反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。ACP分布極廣，遍布各組織主要存在于細胞的溶酶體內(nèi)，為溶酶體標志酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，胞質(zhì)骨巨細胞瘤內(nèi)有豐富的ACP5’-核苷酸酶

（5’-Nucleotidase,5’Nase）催化核糖核苷和去氧核糖核苷在C-5位置水解磷酸酯。反應(yīng)式：酶活性的顯示是由底物中的腺苷酸水解后釋放的磷酸基被重金屬捕捉激活劑：Mg2+，Mn2+抑制劑：NaF(0.1M)，硼酸鈉(0.08M)，Ni(10-3M)5’Nase有同工酶，最適pH有酸性、中性和堿性。中性最適pH7.5。方法：鉛法酶分布較廣泛，所有的生物細胞膜包括微生物在內(nèi)，均具有5’-Nase,是細胞膜的主要標志酶肝、骨、肌、腎上腺髓質(zhì)、腦組織中酶活性較高。葡萄糖-6-磷酸酶

glucose-6-phosphatase,G6PaseG6Pase是具有水解活性和變位活性的多機能酶。組化檢查法是與其水解活性有關(guān)。6-磷酸葡萄糖+H2O──→葡萄糖+磷酸磷酸+Pb2+──→磷酸鉛G6Pase在pH6活性最強，在pH8最穩(wěn)定，而在pH5易變性。組化反應(yīng)用pH6.5-6.7.G6Pase抑制劑：氟化物，Zn2+,CN-,四氧嘧啶短時低溫丙酮固定或不固定。*酒精固定，石蠟包埋，G6Pase完全被抑制。方法：鉛法結(jié)果：酶活性處棕黑色硫化鉛沉淀酶定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標志酶。以肝、腎、腸粘膜、精囊腺、前列腺為強陽性。意義：此酶常用于診斷糖原貯積病Ⅰ型（酶缺乏）癌變過程中G6P不斷減少或消失腺苷三磷酸酶

adenosintriphosphatase，ATPaseATPase只作用于磷酸與磷酸之間的高能鍵，水解三磷酸腺苷為二磷酸腺苷，同時釋放大量能量。具有代表性的ATP酶的分類方法：金屬沉淀法鈣鈷法用來示肌球蛋白ATP酶，也可示線粒體的以及與膜結(jié)合的ATP酶鉛法用于示膜結(jié)合的ATP酶，也可示線粒體酶。酯酶屬于羧酸酯水解酶R-COOR`+H2O＝R-COOH+R'OH分類非特異性酯酶：水解短鏈脂肪酸的酯脂酶：水解長鏈脂肪酸的酯膽堿酯酶：水解膽堿的酯鍵非特異性酯酶

nonspecificesterases是一類分解含短鏈（C2-C4）低級脂肪酸酯，并且沒有底物特異性的酶，能水解α萘酚醋酸。最適pH5.0～8.0方法：偶氮耦聯(lián)法通常用醋酸萘酚或萘酚AS衍生物作底物，在酶的作用下，釋出萘酚，與固藍B或六偶氮對品紅偶聯(lián)成藍棕色或不溶的偶氮染料。應(yīng)用此酶定位于溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在肝、腎、胰和小腸酶活性高單核巨噬細胞含酶最豐富T淋巴細胞局限性點狀陽性，B淋巴細胞陰性用作髓性白血病的鑒別診斷：非特異性酯酶氟化鈉處理后原粒細胞性＋＋原單核細胞性＋－膽堿酯酶乙酰膽堿脂酶(acetycholinesterase，AchE)水解乙酰膽堿分布于神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)、神經(jīng)與肌肉接頭處（運動終板）、紅細胞等，酶的檢測用于追蹤神經(jīng)通路。最適pH7.5~8.0膽堿脂酶(cholinesterase，ChE)水解膽堿的酯見于血清、胰、唾液腺內(nèi)最適pH8.0~8.5抑制劑毒扁豆堿，DFP（二異丙基氟磷酸）抑制AchE和ChE四異丙基焦磷酸酰胺特異性抑制ChEBW284C51特異性抑制AchE方法：亞鐵氰化銅法染色原理作用液碘化乙酰硫代膽堿（底物）5.0mg0.1M順丁烯二酸緩沖液（pH6）6.5ml0.1M檸檬酸鈉0.5ml5M鐵氰化鉀1.0ml30mM(0.75%)CuSO4（捕捉劑）1.0ml蒸餾水（或抑制劑）1.0ml作用條件溫度37℃或室溫；時間30～60min用0.1M蔗糖＋0.1M二甲胂酸鈉緩沖液沖洗洗滌。

氧化還原酶

oxidoreductases

細胞的氧化還原反應(yīng)主要是由氧化還原酶或脫氫酶催化的氧化還原反應(yīng)是由氫的供體把氫原子轉(zhuǎn)移到氫的受體的酶促反應(yīng)，即脫氫酶反應(yīng)脫氫酶脫氫酶是氧化底物，從底物將氫傳遞給受氫體的酶系。不同于氧化酶，合適的受氫體不是大氣中的氧，而是輔酶I、輔酶II（NDAP）或黃素蛋白，然后經(jīng)氫傳遞系統(tǒng)，使受氫體還原顯色，從而達到定位目的。組化示脫氫酶分不需輔酶和必需輔酶二種。脫氫酶的組化方法，以四唑鹽和鐵氰化物為受氫體四唑鹽法的基本原理受氫體琥珀酸脫氫酶

succinatedehydrogenase，SDH

不需輔酶

琥珀酸+受氫體＝＝＝延胡索酸+還原的受氫體方法：硝基藍四唑法Pearson1958最適pH7.6~8.5抑制劑：丙二酸鹽（競爭抑制），磷酸鹽，氯化物，蘇拉明草酰乙酸（競爭抑制），凡與-SH基化合的作用劑皆抑制其活性。SDH作用液的配制：琥珀酸鈉磷酸緩沖液NBT（硝基藍四唑）*DMSO（二甲亞砜）*NBT先溶于DMSO中，再加入上液步驟：新鮮恒冷箱切片作用液15-35分鐘，25℃鹽水洗Fca（氯化鈣Formalin）固定10分鐘80%酒精5分鐘甘油明膠封固結(jié)果：酶活性表現(xiàn)為藍紫色沉淀SDH僅位于線粒體中，可作為線粒體的標志酶含SDH活性高的組織為：心肌、腎小管上皮和肝細胞乳酸脫氫酶

lactatedehydrogenase,LDH需輔酶乳酸鹽+NAD＝＝＝丙酮酸鹽+NADH+H+（輔酶Ⅰ）（還原型輔酶Ⅰ）四唑鹽接受還原型輔酶I的氫而被還原為深色不溶的甲沉淀。最適PH7.4方法：LDH四唑鹽法LDHLDH是糖原分解的酶系肝、骨骼肌中酶活性強同工酶LDH1為心型，與有氧代謝有關(guān)同工酶LDH5為肌型，與厭氧代謝有關(guān)，癌組織因糖酵解LDH5增加過氧化物酶見于乳腺、甲狀腺、唾液腺、肥大細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等胞質(zhì)顆粒中在H2O2存在下氧化各種物質(zhì)（供氫體）AH2（