第四章蛋白質(zhì)化學(xué)

第四章蛋白質(zhì)化學(xué)

（ChemistryofProtein)2006-81第四章蛋白質(zhì)化學(xué)導(dǎo)學(xué)掌握蛋白質(zhì)的分子組成與結(jié)構(gòu)熟悉蛋白質(zhì)的理化；常用分離、純化技術(shù)的基本原理。了解蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；蛋白質(zhì)的分類(lèi)以及重要的活性肽。2006-82第四章蛋白質(zhì)化學(xué)教學(xué)內(nèi)容

蛋白質(zhì)的分子組成

蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化蛋白質(zhì)的分類(lèi)2006-83第四章蛋白質(zhì)化學(xué)第一節(jié)蛋白質(zhì)的分子組成蛋白質(zhì)含量=樣品所含氮量×6.25一、蛋白質(zhì)元素組成：蛋白質(zhì)的特征元素，平均含量：16%CHONS2006-84第四章蛋白質(zhì)化學(xué)二、蛋白質(zhì)的基本組成單位—氨基酸（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)α共同結(jié)構(gòu)2006-85第四章蛋白質(zhì)化學(xué)氨基酸結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：20種編碼氨基酸氨基酸的不同在于R側(cè)鏈不同均為L(zhǎng)-α-氨基酸（甘氨酸、脯氨酸除外）2006-86第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（二）氨基酸的分類(lèi)非極性中性氨基酸極性中性基氨基酸極性酸性氨基酸極性堿性氨基酸根據(jù)R基極性大小分：R基有極性，但不帶電，呈親水性R基無(wú)極性，呈疏水性R基有極性，電離后R基帶負(fù)電荷R基有極性，電離后R基帶正電荷2006-87第四章蛋白質(zhì)化學(xué)非極性中性氨基酸NHCH32CH22006-88第四章蛋白質(zhì)化學(xué)極性中性氨基酸Cys，2006-89第四章蛋白質(zhì)化學(xué)酸性氨基酸2006-810第四章蛋白質(zhì)化學(xué)堿性氨基酸H2N-C-NH—=NH2006-811第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（三）氨基酸的理化性質(zhì)氨基酸具有氨基、羧基等能接受H+而成——NH3+具堿性能電離出H+而成——COO-具酸性?xún)尚噪婋x和等電點(diǎn)2006-812第四章蛋白質(zhì)化學(xué)氨基酸的兩性電離pH<pIpH=pI（兼性離子）pH>pI等電點(diǎn)：氨基酸所帶正負(fù)電荷相等時(shí)溶液的pH（pI）值即該氨基酸的等電點(diǎn)2006-813第四章蛋白質(zhì)化學(xué)2.茚三酮反應(yīng)

（藍(lán)紫色）脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成黃色化合物2006-814第四章蛋白質(zhì)化學(xué)三、肽

（一）肽的形成和命名

肽鍵的形成1.肽鍵2006-815第四章蛋白質(zhì)化學(xué)肽鍵平面2006-816第四章蛋白質(zhì)化學(xué)2.肽的形成與命名肽、寡肽(oligopeptide)、多肽(polypeptide)多肽鏈（polypeptidechain）主鏈骨架（backbone）側(cè)鏈部分（sidechain）羧基末端或C-末端（C-terminus）氨基末端或N-末端（N-terminus）2006-817第四章蛋白質(zhì)化學(xué)多肽鏈的結(jié)構(gòu)

側(cè)鏈N-末端C-末端主鏈骨架HOH2006-818第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（二）體內(nèi)重要的肽

谷胱甘肽（GSH）的結(jié)構(gòu)Glu-Cys-Gly功能基：-SH解毒劑、抗氧化劑2006-819第四章蛋白質(zhì)化學(xué)第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)2006-820第四章蛋白質(zhì)化學(xué)一、一級(jí)結(jié)構(gòu)概念：多肽鏈中氨基酸的組成與排列順序主鍵：肽鍵意義：決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)2006-821第四章蛋白質(zhì)化學(xué)胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)A鏈B鏈2006-822第四章蛋白質(zhì)化學(xué)二、二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondarystructure）定義蛋白質(zhì)分子中由于肽鍵平面的相對(duì)旋轉(zhuǎn)，構(gòu)成的局部空間構(gòu)象。

2006-823第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（一）二級(jí)結(jié)構(gòu)的類(lèi)型α-螺旋β-折疊β-轉(zhuǎn)角無(wú)規(guī)則卷曲2006-824第四章蛋白質(zhì)化學(xué)1.α-螺旋（α-helix）

右手螺旋

每周含3.6個(gè)殘基

螺距0.54nm

作用鍵：氫鍵0.50nm0.54nm氫鍵α-碳原子側(cè)鏈2006-825第四章蛋白質(zhì)化學(xué)2.β-折疊

（β-sheet）鋸齒狀順向平行、逆向平行作用鍵：氫鍵平行俯視側(cè)視反平行俯視側(cè)視2006-826第四章蛋白質(zhì)化學(xué)3.β-轉(zhuǎn)角（β-turn）2006-827第四章蛋白質(zhì)化學(xué)4．無(wú)規(guī)卷曲（randomcoil）肽鏈的肽鍵平面不規(guī)則排列，形成松散的二級(jí)結(jié)構(gòu)。2006-828第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（二）超二級(jí)結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域

超二級(jí)結(jié)構(gòu)（supersecondarystructure）二級(jí)結(jié)構(gòu)單元進(jìn)一步聚集和組合在一起——模序（motif）如αα、βαβ、βββ等

亮氨酸拉鏈和鋅指結(jié)構(gòu)

2006-829第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（二）超二級(jí)結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域（domain）超二級(jí)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步組合、折疊形成的球狀區(qū)域。是蛋白質(zhì)的功能部位2006-830第四章蛋白質(zhì)化學(xué)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域

重鏈輕鏈結(jié)構(gòu)域2006-831第四章蛋白質(zhì)化學(xué)三、三級(jí)結(jié)構(gòu)

（tertiarystructure）定義：在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，所有原子（主鏈+側(cè)鏈）相互作用形成的空間構(gòu)象

2006-832第四章蛋白質(zhì)化學(xué)三、三級(jí)結(jié)構(gòu)

（tertiarystructure）化學(xué)鍵--氫鍵、疏水鍵、離子鍵、二硫鍵等次級(jí)鍵--親水基團(tuán)：分子表面；疏水基團(tuán)：分子內(nèi)部2006-833第四章蛋白質(zhì)化學(xué)三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖二硫鍵極性基團(tuán)離子鍵2006-834第四章蛋白質(zhì)化學(xué)四、四級(jí)結(jié)構(gòu)（quaternarystructre）定義：兩個(gè)或兩個(gè)以上獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過(guò)次級(jí)鍵結(jié)合而形成的空間結(jié)構(gòu)疏水鍵、氫鍵、鹽鍵亞基2006-835第四章蛋白質(zhì)化學(xué)血紅蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖4個(gè)亞基構(gòu)成2α-亞基2β-亞基2006-836第四章蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖2006-837第四章蛋白質(zhì)化學(xué)五、維持蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象的主要化學(xué)鍵

氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德華力、二硫鍵等2006-838第四章蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)分子中的主要次級(jí)鍵

離子鍵疏水鍵二硫鍵氫鍵范德華力2006-839第四章蛋白質(zhì)化學(xué)六、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象決定蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。2006-840第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

某些蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)加工后，才具有生物學(xué)活性。如胰島素原（proinsulin）的一級(jí)結(jié)構(gòu)加工2006-841第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變可引起某些疾病的發(fā)生由于蛋白質(zhì)分子的變異或缺失而產(chǎn)生的疾病，稱(chēng)為分子?。╩oleculardisease）。如鐮狀紅細(xì)胞性貧血2006-842第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（二）空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系空間構(gòu)象決定蛋白質(zhì)功能構(gòu)象改變，功能改變2006-843第四章蛋白質(zhì)化學(xué)血紅蛋白結(jié)合氧前后構(gòu)象的變化當(dāng)血紅蛋白結(jié)合氧以后，α1β1與α2β2兩個(gè)二聚體彼此滑動(dòng)15°，其構(gòu)象由T（tense）型轉(zhuǎn)變?yōu)镽（relaxed）型。Hb(T態(tài))HbO2(R態(tài))α1β1α2β215o2006-844第四章蛋白質(zhì)化學(xué)任何一個(gè)亞基接受氧分子后，會(huì)增進(jìn)其它亞基吸附氧分子的能力環(huán)境氧濃度高時(shí)Hb快速吸收氧分子環(huán)境氧濃度低時(shí)Hb快速釋出氧分子動(dòng)脈靜脈血紅蛋白對(duì)氧的運(yùn)輸2006-845第四章蛋白質(zhì)化學(xué)第三節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化2006-846第四章蛋白質(zhì)化學(xué)一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（一）蛋白質(zhì)的一般性質(zhì)

1.蛋白質(zhì)的紫外吸收特征蛋白質(zhì)（色氨酸、酪氨酸）（苯丙氨酸）

λ=280nmλ=260nm

紫外吸收（與蛋白質(zhì)濃度成正比）2006-847第四章蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)的紫外吸收10,000100010010

200250300波長(zhǎng)（nm）TrpPheTyr摩爾吸光度（M-1cm-1）2006-848第四章蛋白質(zhì)化學(xué)2.蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn)與氨基酸的兩性電離、等電點(diǎn)相同2006-849第四章蛋白質(zhì)化學(xué)雙縮脲反應(yīng)：

Cu2+

蛋白質(zhì)紫色絡(luò)合物

OH-3.蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)顏色反應(yīng)→光吸收→定量分析2006-850第四章蛋白質(zhì)化學(xué)3.蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)顏色反應(yīng)→光吸收→定量分析酚試劑反應(yīng)：

磷鎢酸蛋白質(zhì)藍(lán)色化合物

磷鉬酸2006-851第四章蛋白質(zhì)化學(xué)米倫試劑反應(yīng)：

米倫試劑蛋白質(zhì)紅色沉淀

△3.蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)顏色反應(yīng)→光吸收→定量分析2006-852第四章蛋白質(zhì)化學(xué)考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)：

考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)（R-250）紅藍(lán)色

（G-250）藍(lán)綠色3.蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)顏色反應(yīng)→光吸收→定量分析2006-853第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（二）蛋白質(zhì)的高分子性質(zhì)1.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的直徑在膠體顆粒的范圍(1~100nm)蛋白質(zhì)溶液是穩(wěn)定親水膠體溶液穩(wěn)定因素：水化膜、同種電荷2006-854第四章蛋白質(zhì)化學(xué)堿堿酸酸

2006-855第四章蛋白質(zhì)化學(xué)2.蛋白質(zhì)的擴(kuò)散與沉降蛋白質(zhì)分子大，擴(kuò)散速度慢沉降：通過(guò)超速離心克服布朗運(yùn)動(dòng)使蛋白質(zhì)顆粒下沉的現(xiàn)象沉降系數(shù)（S）可粗略反映蛋白質(zhì)分子大小2006-856第四章蛋白質(zhì)化學(xué)3.蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性變性劑蛋白質(zhì)空間構(gòu)象破壞生物學(xué)活性喪失理化性質(zhì)改變加熱、酸堿、有機(jī)溶劑、尿素、鹽酸胍、去污劑易水解易沉淀蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵和二硫鍵破壞，不涉及肽鍵2006-857第四章蛋白質(zhì)化學(xué)復(fù)性：去除變性因素，蛋白質(zhì)恢復(fù)空間構(gòu)象與生物學(xué)活性的過(guò)程3.蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性2006-858第四章蛋白質(zhì)化學(xué)核糖核酸酶的變性與復(fù)性示意圖8M尿素或β-巰基乙醇透析2006-859第四章蛋白質(zhì)化學(xué)某些蛋白質(zhì)在發(fā)生熱變性后，松散的多肽鏈相互纏繞在一起，變成固體狀態(tài)，稱(chēng)為蛋白質(zhì)的凝固（coagulation）。2006-860第四章蛋白質(zhì)化學(xué)二、蛋白質(zhì)的分離純化鑒定技術(shù)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)常與核酸、多糖、脂類(lèi)及其它小分子物質(zhì)結(jié)合在一起，需要對(duì)其進(jìn)行分離、純化與鑒定。2006-861第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（一）離心原理：分子大小、密度不同→沉降速度不同分類(lèi)：普通離心：3~10kr/min

高速離心：10~25kr/min

超速離心：＞25kr/min常用S值表示蛋白質(zhì)分子質(zhì)量相對(duì)大小2006-862第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（二）透析

(dialysis)用透析袋（半透膜）把大分子和小分子分開(kāi)的方法2006-863第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（三）沉淀(precipitation)定義：蛋白質(zhì)分子相互聚集從溶液中析出的現(xiàn)象原理：破壞同種電荷和水化膜2006-864第四章蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)的沉淀示意圖2006-865第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（三）沉淀(precipitation)方法：

鹽析法

有機(jī)溶劑沉淀法

重金屬鹽沉淀法

生物堿試劑沉淀法2006-866第四章蛋白質(zhì)化學(xué)1.鹽析（saltingout）法

定義：高濃度中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中析出沉淀的方法原理：破壞水化膜、中和電荷特點(diǎn)：蛋白質(zhì)不變性分段鹽析：不同濃度的中性鹽分離不同蛋白質(zhì)2006-867第四章蛋白質(zhì)化學(xué)2.有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)

原理：破壞水化膜條件：pH=pI特點(diǎn)：常在低溫下進(jìn)行常用有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮等2006-868第四章蛋白質(zhì)化學(xué)3.重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)原理：中和負(fù)電荷條件：pH＞pI特點(diǎn)：蛋白質(zhì)變性2006-869第四章蛋白質(zhì)化學(xué)4.生物堿試劑與某些酸類(lèi)沉淀蛋白質(zhì)原理：中和正電荷條件：pH＜pI特點(diǎn)：蛋白質(zhì)變性常用酸類(lèi)：苦味酸、鞣酸、鎢酸、三氯醋酸、硝酸、過(guò)氯酸等2006-870第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（四）蛋白質(zhì)層析

（chromatography）定義：待分離的液體（流動(dòng)相mobilephase）經(jīng)過(guò)一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相solidphase)后所發(fā)生的各組分在兩相中分布的變化。原理：根據(jù)混合物溶液中蛋白質(zhì)分子的大小、形狀、極性、親和力等差異而加以分離。2006-871第四章蛋白質(zhì)化學(xué)類(lèi)型：離子交換層析（ionexchangechromatography）凝膠過(guò)濾層析(gelfiltrationchromatography)親和層析(affinitychromatography)（四）蛋白質(zhì)層析（chromatography）2006-872第四章蛋白質(zhì)化學(xué)離子交換層析凝膠過(guò)濾層析親和層析2006-873第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（五）電泳（electrophoresis）定義：帶電顆粒在電場(chǎng)中將向與自身電荷相反的電極移動(dòng)，從而到達(dá)分離的方法。2006-874第四章蛋白質(zhì)化學(xué)常用的電泳技術(shù)：瓊脂糖凝膠電泳（agarosegelelectrophoresis，AGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）等電聚焦電泳（isoelectricfocusing，IEF）雙向電泳（twodimensionalelectrophoresis，2DE）毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis，CE）（五）電泳（electrophoresis）2006-875第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（六）westernblotting（蛋白印跡法，免疫印跡法）

把電泳分離的蛋白組分轉(zhuǎn)移到固定膜（如硝酸纖維素膜、尼龍膜或PVDF膜）上的技術(shù)，稱(chēng)為蛋白印跡（westernblotting）。

2006-876第四章蛋白質(zhì)化學(xué)2006-877第四章蛋白質(zhì)化學(xué)（七）蛋白質(zhì)芯片將已知蛋白質(zhì)固化于固體支持物上，利用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，對(duì)未知蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的方法。2006-878第四章蛋白質(zhì)化學(xué)2006-879第四章蛋白質(zhì)化學(xué)第四節(jié)蛋白質(zhì)的分類(lèi)根