分析CGRP參與LHb對(duì)痛覺(jué)的調(diào)節(jié)作用,免疫學(xué)論文

分析CGRP參與LHb對(duì)痛覺(jué)的調(diào)節(jié)作用,免疫學(xué)論文降鈣素基因相關(guān)肽是一種由37個(gè)氨基酸殘基組成的神經(jīng)肽,屬于降鈣素基因相關(guān)肽家族[1].它是和降鈣素(Calcitonin,CT)在不同組織中由同一基因在進(jìn)行基因重組后構(gòu)成,在心臟和神經(jīng)系統(tǒng)中主要轉(zhuǎn)錄表示出成CGRP,而在甲狀腺主要轉(zhuǎn)錄表示出成CT.人類(lèi)的CGRP有和兩種分子形式,且都有生物活性.CGRP廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中,并通過(guò)激活細(xì)胞膜上的CGRP受體的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)而激活腺苷酸環(huán)化酶,促使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高而產(chǎn)生多種生理作用,如感覺(jué)、心血管活動(dòng)、運(yùn)動(dòng)、睡眠、呼吸、體溫調(diào)節(jié)等[2-5].同時(shí),利用免疫組織化學(xué)觀察到在硬腦膜上有大量的CGRP免疫反響性的神經(jīng)纖維存在[6].有研究表示清楚,側(cè)腦室注射CGRP能明顯抑制壓力的感受性反射[7],表示清楚CGRP在大鼠側(cè)腦室內(nèi)具有鎮(zhèn)痛作用.脊髓以上水平,在多個(gè)與痛覺(jué)密切相關(guān)的腦區(qū)內(nèi),如中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(Periaqueductalgray,PAG)、中縫大核(Nucleusraphemagnus,NRM)、伏核(NAc)和杏仁核(Centralnucleusofamygdale,CeA)等都發(fā)現(xiàn)過(guò)CGRP及其受體[8-10].韁核(Habenularcomplexes,Hb)是在鎮(zhèn)痛作用中非常重要的核團(tuán),存在于脊椎動(dòng)物的背側(cè)間腦,可分為內(nèi)側(cè)韁核(Medialhabenularcomplex,MHb)和外側(cè)韁核(Lateralhabenularcomplex,LHb)[11-13],而且LHb是杏仁核、海馬、視前區(qū)等邊緣系統(tǒng)到中腦的樞紐.有關(guān)CGRP在LHb內(nèi)對(duì)大鼠痛覺(jué)調(diào)節(jié)的影響國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道,因而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠的LHb微量注射CGRP,采用熱板和壓板測(cè)痛儀來(lái)測(cè)量大鼠對(duì)傷害性熱刺激和機(jī)械刺激所引起的HWL,并將其作為衡量大鼠痛覺(jué)的指標(biāo),進(jìn)而分析CGRP介入LHb對(duì)痛覺(jué)的調(diào)節(jié)作用,能夠?yàn)榻沂綜GRP在脊髓水平以上的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制提供新的位點(diǎn),并為CGRP受體沖動(dòng)劑和拮抗劑的臨床應(yīng)用提供根據(jù).1材料與方式方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用成年雄性Wistar大鼠(由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)8只,體重均在180~250g之間,實(shí)驗(yàn)期間分籠飼養(yǎng),自然光照,自由飲水與進(jìn)食,飼養(yǎng)溫度16~24℃.1.1.2試劑與藥品降鈣素基因相關(guān)肽(上海強(qiáng)耀生物科技有限公司提供)用生理鹽水配置成濃度為0.875、1.75、3.5和7nmol/l,10%水合氯醛,醫(yī)用酒精,H2O2,亞甲基藍(lán),牙托粉和牙脫水等.1.1.3實(shí)驗(yàn)器材智能熱板儀(YLS-6B),電子壓痛儀(LYS-3E),均由安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn).手術(shù)器械、注射器、腦立體定位儀(深圳瑞沃德公司生產(chǎn)).1.2實(shí)驗(yàn)方式方法1.2.1實(shí)驗(yàn)前期工作為了使大鼠熟悉測(cè)試環(huán)境,并減小實(shí)驗(yàn)誤差,在實(shí)驗(yàn)開(kāi)場(chǎng)之前需要對(duì)大鼠進(jìn)行熱板和壓力測(cè)試訓(xùn)練.根據(jù)孫衍剛等[13]給出的實(shí)驗(yàn)方式方法,訓(xùn)練進(jìn)行5d,天天5輪,每輪3次.經(jīng)過(guò)訓(xùn)練后大鼠的HWL會(huì)維持在一個(gè)比擬穩(wěn)定的范圍,熱板測(cè)試大約為3~5s之間,壓力測(cè)試大約為5~7s之間.1.2.2核團(tuán)微量注射用水合氯醛腹腔麻醉,將大鼠的頭部水平固定在腦立體定位儀上,暴露頭骨,參考Watson鼠圖譜在外側(cè)韁核定位,將不銹鋼套管插入,用牙托粉和牙脫水固定,封住套管和顱骨之間的縫隙.手術(shù)后恢復(fù)2~3d后進(jìn)行行為痛覺(jué)測(cè)試.進(jìn)行核團(tuán)微量注射前,將注射器插入套管,緩慢注射藥物,每次注射后應(yīng)讓注射針在管里停留片刻再將之取出.1.2.3行為痛覺(jué)測(cè)試熱板測(cè)試:熱板的溫度維持在52℃(51.7℃~52.3℃),將大鼠的待測(cè)后爪緊貼于熱板上,并開(kāi)場(chǎng)計(jì)時(shí),待大鼠后爪感覺(jué)到疼痛,主動(dòng)回縮離開(kāi)熱板時(shí)停止計(jì)時(shí).記錄注射CGRP和注射生理鹽水對(duì)照組大鼠的HWL.壓力測(cè)試:使用壓力測(cè)痛儀對(duì)大鼠進(jìn)行壓力測(cè)試,用腳踩住開(kāi)關(guān),使小楔形有機(jī)玻璃壓在鼠爪的跗跖關(guān)節(jié)處,待大鼠后爪感覺(jué)到疼痛時(shí),會(huì)往回收縮,此時(shí)停止計(jì)時(shí),記錄注射CGRP和注射生理鹽水對(duì)照組大鼠的HWL.1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)均以x-s形式表示,組間比照用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方式方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理.P0.05,P0.01,P0.001表示統(tǒng)計(jì)結(jié)果具有顯著差異性.2結(jié)果2.1LHb內(nèi)微量濃度為0.875、1.75、3.5和7nmol/l的CGRP的結(jié)果見(jiàn)表1~4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚,LHb內(nèi)微量注射0.875nmol/lCGRP組與對(duì)照組相比大鼠左爪熱刺激HWL有差異(P0.05),對(duì)大鼠右爪熱刺激HWL有顯著差異(P0.001),見(jiàn)表1;微量注射濃度為1.75、3.5和7nmol/lCGRP與對(duì)照組相比引起大鼠左、右爪熱刺激HWL有顯著性差異(P0.001),見(jiàn)表2~4.LHb內(nèi)微量注射0.875nmol/lCGRP與對(duì)照組相比大鼠左爪機(jī)械刺激HWL有顯著差異(P0.001),而對(duì)大鼠右爪機(jī)械刺激HWL無(wú)差異(P0.05)見(jiàn)表1;微量注射濃度為1.75、3.5和7nmol/lCGRP組與對(duì)照組相比引起大鼠左、右爪機(jī)械刺激HWL有顯著性差異(P0.001),見(jiàn)表2~4.即LHb內(nèi)微量注射CGRP能夠引起明顯的鎮(zhèn)痛作用.2.2CGRP對(duì)正常大鼠的鎮(zhèn)痛作用具有劑量依靠性,且在20min時(shí)鎮(zhèn)痛效果最為明顯,如此圖1所示.3討論當(dāng)前應(yīng)用于臨床的鎮(zhèn)痛藥物多為嗎啡、杜冷丁等阿片類(lèi)藥物,在讓病人忘記疼痛的同時(shí),也會(huì)產(chǎn)生耐藥性以及成癮性[14-16].因而,研究新型鎮(zhèn)痛藥物具有重要的生理學(xué)意義.而CGRP作為一種新型的神經(jīng)肽,在體內(nèi)分布廣,功能多,并且能夠避免阿片類(lèi)藥物的成癮性等副作用,研究其在中樞水平的鎮(zhèn)痛作用,在臨床具有特別廣闊的意義.本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)大鼠LHb分別微量注射CGRP(用生理鹽水配置)和生理鹽水的方式方法,來(lái)討論CGRP對(duì)大鼠痛覺(jué)的調(diào)節(jié)作用.結(jié)果表示清楚,注射CGRP組的大鼠與注射生理鹽水組的大鼠相比,HWL明顯增加,講明CGRP在大鼠的LHb起到了鎮(zhèn)痛作用,并且這種鎮(zhèn)痛效果在20min左右最為明顯,具有時(shí)間上的規(guī)律性.除此之外,有學(xué)者研究CGRP在大鼠扣帶束及周?chē)べ|(zhì)對(duì)傷害性刺激反響的作用,結(jié)果表示清楚注射一定劑量的CGRP能顯著降低大鼠對(duì)機(jī)械刺激的HWL,使大鼠對(duì)熱板和機(jī)械壓力刺激產(chǎn)生痛敏反響,同樣有研究表示清楚,在腦內(nèi)某些核團(tuán)微量注射CGRP均能延長(zhǎng)大鼠的HWL值,如中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)、側(cè)腦室等[7,8,17].這是由于降鈣素基因相關(guān)肽所在部位不同,與其不同受體結(jié)合導(dǎo)致的作用結(jié)果可能會(huì)不一樣所致.在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),對(duì)大鼠LHb微量注射4個(gè)不同濃度(0.875、1.75、3.5和7nmol/l)的CGRP作用效果不同,大鼠的后爪縮爪反響潛伏期也有顯著差異.通過(guò)觀察圖表,能夠得出結(jié)論,隨著注射CGRP濃度的逐步增加,大鼠的HWL也逐步增加,講明CGRP具有鎮(zhèn)痛作用且具有劑量依靠性.根據(jù)不同的藥理學(xué)特征,能夠?qū)GRP受體分為兩類(lèi),即CGRP1受體和CGRP2受體.有研究表示清楚,CGRP2受體可被CGRP所激動(dòng)[3-8],但是對(duì)CGRP8-37的拮抗作用不明顯;而相反的CGRP1受體對(duì)CGRP8-37的阻斷效應(yīng)較為敏感,但是高劑量的GGRP8-37可以以成為受體的沖動(dòng)劑[17].同時(shí),Bartho等[18]也發(fā)現(xiàn)CGRP受體的阻斷劑CGRP8-37能夠部分逆轉(zhuǎn)由辣椒素所誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏及異常疼痛[19].但CGRP在LHb對(duì)大鼠的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制尚不特別清楚,有待于一步的討論研究.以下為參考文獻(xiàn):[1]于龍川主編.神經(jīng)生物學(xué)[M].北京:北京大學(xué)出版社,2020:141-147.[2]DobolyiA,IrwinS,MakaraG,etal.Calcitoningene-relatedpep-tide-containingpathwaysintheratforebrain[J].JCompNeurol,2005,489(1):92-199.[3]PoynerDR.Pharmacologyofreceptorsforcalcitoningene-relatedpeptideandamylin[J].Tre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