第六章芳酸類非甾體抗炎藥物分析

TianjinMedicalUniversity天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院《藥物分析》第六章——芳酸類非甾體抗炎藥物的分析1芳酸類藥物概述：分類與共性內(nèi)容：2芳酸類藥物分析方法簡介3總結(jié)與練習(xí)炎癥（inflammation）是具有血管系統(tǒng)的活體組織對外源性或內(nèi)源性損傷因子所發(fā)生的一種機體的防御性反應(yīng)。病理變化為局部組織的變質(zhì)（alteration）、滲出（exudation）和增生（proliferation），臨床表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛和功能障礙?？寡姿幬锿ㄟ^抑制炎癥因子產(chǎn)生或釋放，降低過于強烈的炎癥反應(yīng)，減輕發(fā)熱疼痛癥狀，防止功能障礙等不良反應(yīng)的發(fā)生。臨床常用的抗炎藥物分為兩大類：甾體類抗炎免疫藥（steroidanti-inflammatory-immunitydrugs，SAIDs）：

主要作用于皮質(zhì)激素受體（cortisolreceptors），但長期使用可產(chǎn)生依賴性和嚴重的副作用。非甾體抗炎藥（nonsterodialanti-inflammatorydrugs，NSAIDs）：

無皮質(zhì)激素樣副作用，是臨床上廣泛使用的治療各種急慢性炎癥的基礎(chǔ)用藥。其作用機理主要通過抑制環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）活性，阻斷花生四烯酸（arachidonicacid，AA）代謝形成前列腺素（PGs），抑制由前列腺素引起的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎的作用。公元前400年，希波克拉底Hippcrates，描述了從柳樹干提取的某種物質(zhì)可以用來治療發(fā)熱、疼痛以及由于勞損引起的劇痛。公元前1500年，古埃及人便發(fā)現(xiàn)“柳樹皮可以止痛（風濕，關(guān)節(jié)炎）”。1897年，霍夫曼研制了高純度乙酰水楊酸，并為自己父親治好了多年的風濕病。(艾興格林)

1899年，阿司匹林（aspirin）問世。此后被廣泛用于解熱、鎮(zhèn)痛及抗風濕治療。in是拜耳公司特有的在一種藥名上加的后綴，代表該公司為這個藥物的唯一生產(chǎn)商。ASPIRINA

SPIR

INAcetyl

Spiraea(繡線菊，水楊酸提取物）乙酰水楊酸ASPIRINA

SPIR

IN乙酰水楊酸《藥物化學(xué)》《藥劑學(xué)》……全面質(zhì)量控制《藥物分析》阿司匹林，1898年首次合成。阿司匹林類非甾體抗炎藥的作用機制，1971年Vane團隊發(fā)現(xiàn)。COX-1,1976年首次提純。COX-2,1991年被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)作用機制分為傳統(tǒng)非甾體抗炎藥物（水楊酸類、吡唑酮類、芳基烷酸類、苯并噻嗪類）、選擇性COX-2抑制劑、新型非甾體抗炎藥三部分。1.1水楊酸類1芳酸類藥物概述：分類與共性水楊酸SalicylicAcid阿司匹林Aspirin雙水楊酯Salsalate二氟尼柳Diflunisal羧基與COX的精氨酸120（Arg-120）的胍基形成離子對，是保持活性的必要結(jié)構(gòu)。羧基與羥基的位置若從鄰位移到間位或?qū)ξ?，活性則消失。1.2芳基烷酸類芳基乙酸類吲哚乙酸類吲哚美辛Indometacin芳基丙酸類布洛芬Ibuprofen酮洛芬Ketoprofen萘普生Naproxen鄰氨基苯甲酸類（滅酸類）甲酚那酸MefenamicAcid雙氯芬酸鈉DiclofenacSodium鄰氨基苯乙酸類

1.酸性：SA(PKa2.95)、ASA(PKa3.49)、雙水楊酯均有酸性。布

洛芬等由于羧基并未與苯環(huán)相連，結(jié)構(gòu)上屬于芳環(huán)取代

的脂肪酸，酸性較弱。多數(shù)有游離的羧基，可用NaOH

直接滴定測定其含量。

2.溶解性:

均為白色結(jié)晶粉末。除鈉鹽略溶于水，其余幾乎不

溶或微溶。

3.UV和IR光譜特性：分子結(jié)構(gòu)中具有苯環(huán),有UV和IR特征吸收。

4.鄰羥基苯甲酸特性：與FeCl3生成紫色配合物。5.水解特性：酯鍵易水解。ASA、雙水楊酯及其制劑應(yīng)檢查游離

水楊酸。

6.基團或元素特征：雙氯芬酸鈉含有Cl，可用于鑒別反應(yīng)。酮

洛芬的二苯甲酮結(jié)構(gòu)可與苯肼縮合顯色。主要理化性質(zhì)1.3苯并噻嗪甲酸類（昔康類）吡羅昔康Piroxicam美洛昔康Meloxicam對乙酰氨基酚Paracetamol其他類尼美舒利Nimesulide磺酰苯胺類（選擇性COX-2抑制劑）主要理化性質(zhì)1.酸性：具有酰胺結(jié)構(gòu)，無明顯酸性。

2.溶解性:

均為結(jié)晶粉末。除對乙氨基酚略溶于水，

其余幾乎不溶。

酚羥基特性：與FeCl3生成顯色配合物。吡羅昔康與美洛昔康的烯醇式羥基

也具有酚羥基性質(zhì)。水解特性：酰胺鍵可發(fā)生水解反應(yīng)，用于鑒別與含量測定。

基團或元素特征：對乙氨基酚具有潛在芳伯胺基，可發(fā)生重氮偶合反應(yīng)顯色。美洛昔康含有二價硫，經(jīng)高溫生成硫化氫使醋酸鉛試紙顯黑色。

一、與三氯化鐵反應(yīng)

含有酚羥基藥物可與FeCl3反應(yīng)；能與FeCl3反應(yīng)不一定含酚羥基.第二節(jié)鑒別試驗Ar-OH+FeCl3紫堇色鐵配位化合物pH4~6直接反應(yīng)

水楊酸在中性或弱酸性條件下，與FeCl3生成紫堇色配位化合物，強酸條件下配合物可分解。二氟尼柳溶于乙醇后，與FeCl3反應(yīng)呈深紫色。雙水楊酯在NaOH中煮沸后FeCl3

反應(yīng)，成紫色。2.水解或分解后與三氯化鐵反應(yīng)ASA水解成SA后與FeCl3

反應(yīng)，成紫堇色。對乙酰氨基酚水溶液與FeCl3生成藍紫色配位化合物，吡羅昔康顯玫瑰紅色，美洛昔康顯淡紫紅色。二、縮合反應(yīng)酮洛芬具有二苯甲酮結(jié)構(gòu)，在酸性條件下可與二硝基苯肼縮合生成橙色偶氮化合物。三、重氮化-偶合反應(yīng)凡是分子結(jié)構(gòu)中含有芳伯氨基或潛在芳伯氨基的藥物均可反應(yīng)。

1.直接反應(yīng)

對氨基水楊酸鈉

2.水解后反應(yīng)對乙酰氨基酚具有潛在芳伯氨基

3.甲芬那酸與對-硝基苯重氮鹽在NaOH介質(zhì)中偶合產(chǎn)生橙紅色。

+K2Cr2O7

深藍色

棕綠色甲芬那酸+H2SO4

黃色

綠色熒光△四、氧化反應(yīng)

+H2SO4+K2Cr2O7

紫色吲哚美辛

+HCl+NaNO2

綠色黃色

雙水楊酯在NaOH下煮沸水解后，加HCl生成SA沉淀，沉淀在醋酸銨試液中可溶解。五、水解反應(yīng)

1.測定λmax；λmin。（布洛芬及美洛昔康制劑）

例如：布洛芬用0.4%NaOH溶液制備0.25mg/ml；λmax：265nm,273nm;λmin：245nm,271nm。

2.測定λmax。

例如：雙氯芬酸鈉，20μg/mlλmax=276nm；

吡羅昔康片，λmax=243nm，334nm。

3.在λmax處測定一定濃度供試液的吸收度A。

例如：甲酚那酸，20μg/ml在λmax=279nm，350nm;A=0.69~0.74與0.56~0.60。

六、紫外吸收光譜法

4.在規(guī)定的波長測定吸收度比值（即雙波長吸收度比值法）例如：二氟尼柳20μg/ml;A251/A315=4.2~4.6

再例如：甲芬那酸14μg/ml;A278~280/A348~352=1.15~1.30

七、紅外吸收光譜法水楊酸的紅外吸收圖譜3700~2900cm-1N-H、O-H1660cm-1C=O1610,15701480,1440C=C775cm-1Ar-H3300~2300cm-1O-H1760,1690cm-1Ar-H1610,1570,1480,1460cm-1C=C775cm-11310,1230,1180cm-1C-O阿司匹林的紅外吸收圖譜C=O二氟尼柳膠囊的鑒別：以GF254為固定相，正己烷-二氧六環(huán)-冰醋酸（85:10:5）為展開劑，254nm檢視。美洛昔康制劑：以三氯甲烷-甲醇-二乙胺（60:5:7.5）為展開劑。七、薄層色譜法八、HPLC法離子對色譜法（pairedionchromatography，PIC）RPIC是把離子對試劑加至極性流動相中，被分析的樣品離子在流動相中與離子對試劑生成不荷電的中性離子對，從而增加了樣品離子在非極性固定相中的溶解度，使分配系數(shù)增加，改善分離效果。分配系數(shù)與離子對試劑的碳鏈長度及被分離組分的極性有關(guān)。分配系數(shù)越大，保留時間越長。流動相固定相B+HBH+

+RSO3NaRSO3-+Na+(PICB)

中性離子對

[BH+.RSO3-][BH+.RSO3-]常用離子對試劑通常所選用離子對試劑的電荷應(yīng)與被分離樣品的電荷相反。PICB：用于分離堿類或帶正電荷的物質(zhì)，常用帶負電荷的烷基磺酸鈉，如庚烷磺酸鈉（PICB7）。PICA：用于分離酸類或帶負電荷的物質(zhì)，常用帶正電荷的季銨鹽，如四丁基氫氧化銨、十六烷基三甲基溴化銨。離子抑制色譜（ionsuppressionchromatography，ISC）在反相色譜中，通過調(diào)節(jié)流動相的PH或利用同離子效應(yīng)，抑制樣品組分的解離，增加它在固定相中的溶解度，以達到分離有機弱酸、弱堿的目的的技術(shù)。適用于3.0-7.0的弱酸及7.0-8.0的弱堿，對于小于3.0的酸及大于8.0的堿，應(yīng)采用離子對色譜或離子交換色譜。常用抑制劑：弱酸（乙酸）、弱堿（氨水）、緩沖鹽（磷酸鹽、乙酸鹽）PIC與ISC區(qū)別分離機制不同

ISC使組分保持分子狀態(tài)，抑制離子是組分自身離子；PIC是形成不荷電離子對，抑制離子是外來的。分離對象范圍不同ISC適用有機弱酸、弱堿、兩性化合物；PIC適用更廣泛些。ISC簡便，比PIC經(jīng)濟，但重復(fù)性較差。

第三節(jié)特殊雜質(zhì)檢查阿司匹林及水楊酯合成路線一、ASA中特殊雜質(zhì)的檢查

1.游離水楊酸檢查

利用SA可與FeCl3呈色，用比色法檢查。Chp2010采用1%冰醋酸甲醇溶液制備供試品，防止阿司匹林水解，采用HPLC法，ODS反相色譜柱，以乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水（20:5:5:70）為流動相，檢測波長為303nm，外標法以峰面積計算SA不得過0.1%。藥典規(guī)定ASA片、腸溶片、腸溶膠囊、泡騰片及栓劑限度檢查SA，分別為0.3%、1.5%、1.0%、3.0%和3.0%。

一、ASA中特殊雜質(zhì)的檢查

1.有關(guān)物質(zhì)合成原料苯酚及其他合成副產(chǎn)物。Chp采用HPLC法檢查。使用ODS色譜柱，以檢查游離水楊酸的流動相為A，乙腈為B，梯度洗脫，波長為276nm。

甲芬那酸是以鄰-氯苯甲酸和2，3-二甲基苯胺在Cu的催化下縮合而成，因此成品藥物中要檢查銅鹽及有關(guān)物質(zhì)。

分光光度法：利用Cu2+與Na-DDC呈色后測定A

1.銅鹽檢查法

原子吸收分光光度法：BP（2000）

2.有關(guān)物質(zhì)的檢查

主要檢查的是2,3-二甲基苯胺，Chp采用GC

法，限度為0.01%。二、甲芬那酸中特殊雜質(zhì)的檢查三、二氟尼柳中有關(guān)物質(zhì)的檢查合成路線Chp分別采用TLC（正相）和（反相）HPLC法，以自身對照法檢查有關(guān)物質(zhì)A和B。四、萘普生中有關(guān)物質(zhì)的檢查合成路線Chp采用HPLC法。采用雜質(zhì)對照品法。檢出雜質(zhì)峰面積不得大于對照雜質(zhì)峰面積（0.1%），其他雜質(zhì)峰面積不得大于對照雜質(zhì)I峰面積的2倍，雜質(zhì)總面積不得大于對照主成分面積（0.5%）。五、對乙氨基酚中氨基酚和對氯苯乙酰胺的檢查

取對氨基酚適量，精密稱定，加溶劑甲醇-水4：6制成每1ml中含20mg的溶液，作為供試品溶液；另取對氨基酚對照品和對乙酰氨基酚對照品適量，精密稱定，加上述溶劑溶解并制成每1ml中含對氨基酚1ug和對乙酰氨基酚20ug的混合溶液，作為對照品溶液。照HPLC法試驗。用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鈉8.95g，磷酸二氫鈉3.9g，加水溶解至1000ml，加10%四丁基氫氧化銨溶液12ml）-甲醇90：10為流動相。檢測波長為245nm，柱溫為40度，理論板數(shù)不低于2000，分離度應(yīng)符合要求。L=VC/S

一、酸堿滴定法（一）直接滴定法基于本類藥物-COOH；可用堿直接滴定，如ASA的含量測定，其原理如下：第四節(jié)

含量測定1.原理：2.條件：在中性乙醇中，以酚酞作指示劑；摩爾比為1:1。3.應(yīng)用：多國藥典用于雙水楊酯、苯甲酸、丙磺舒、布洛芬測定；USP和BP還用于甲芬那酸的測定。（二）水解后剩余滴定法

ASA含量測定原理：條件：水溶液注意事項：堿液在受熱時易吸收二氧化碳，生成碳酸鹽，使酸回滴體積減少，使結(jié)果偏高，故需在相同條件下進行空白實驗。具體試驗：I份NaOHI份NaOHVVOVo-V相當于ASA消耗

硫酸的ml數(shù)ASA%=(Vo–V)×F×T/W×100%（三）兩步滴定法

ASA片的含量測定第一步為中和ASA+NaOHASA-Na+H2O水解產(chǎn)物SA+NaOHSA-Na+H2O酸性穩(wěn)定劑+NaOH中性鹽第二步為水解與測定2NaOH+H2SO4→Na2SO4+2H2O（剩余）從阿司匹林結(jié)構(gòu)出發(fā)，試述其片劑的鑒別方法，特殊雜質(zhì)水楊酸的檢查方法以及其含量測定方法,包括原理、操作要點（限容量分析法，需寫出反應(yīng)方程式）。

取本品20片（1.4801g）標示量25mg/片,每份12片（0.8908g），（約相當于阿司匹林0.3g）研細，計算平均片重。置錐形瓶中，加中性乙醇（對酚酞指示液顯中性）20ml，振搖使阿司匹林溶解．加酚酞指示液3滴，滴加氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)至溶液顯粉紅色（約耗NaOH20mL），再精密加氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)40mL。置水浴上加熱15分鐘并時時振搖，迅速放冷（涼水沖冷）至室溫，用硫酸滴定液(0.05mol／L)滴定（約消耗18-19mL）至粉紅色消失，并將滴定結(jié)果用空白實驗校正。每lml氫氧化鈉滴定液(0.1mol／L)相當于18.02mg的C9H8O4。CH2SO4=0.05716mol/L;Vs=18.86mL;V0=33.24mL中國藥典（2005）規(guī)定，本品含阿司匹林(C9H804)應(yīng)為標示量的95．0％～105．0％。（三）兩步滴定法

標示量%=（VO–VS)×F×T×W平/W/B×100%注意事項：1.中和滴定速度稍快，注意旋搖，防止局部過濃2.本實驗中，中性乙醇對酚酞指示液顯中性。3.阿司匹林在水中微溶，在乙醇中易溶，故選用乙醇為溶劑，且乙醇可抑制阿司匹林的水解。

（四）、非水溶液滴定法

吡羅昔康有吡啶環(huán)，顯堿性，可在冰醋酸中用高氯酸滴定液滴定。（一）直接紫外分光光度法

Chp2010收載二氟尼柳、美洛昔康、尼美舒利制劑，對乙酰氨基酚及其部分制劑采用此法進行測定。四、紫外分光光度法標示量%=As×CR×D×WAR×W×B×100%（二）柱分配色譜-紫外分光光度法

USP(24)采用此法同時測定ASA膠囊中ASA和SA。

1.SA的限量測定

色譜柱的制備；對照品溶液的制備；供試品溶液的制備。

2.ASA的含量測定色譜柱的制備；對照品溶液的制備；供試品溶液的制備。供試品液：CHCl3液洗脫液1：CHCl3洗脫液2：HAC-

乙醚硅藻土，F(xiàn)eCl3-尿素玻璃棉硅藻土，Na2CO3供試品液：CHCl3-HCl液洗脫液1：HAC-CHCl3

(1:10)10ml洗脫液2：HAC-CHCl3(1:100)85ml

1-雜質(zhì)先洗脫2-SA后洗脫max=306nmAu＜As1-雜質(zhì)先洗脫2-ASA后洗脫max=280nmASA(mg)=C(Au/As)

Ch.P(2010)收載的典型芳酸類非甾體抗炎藥物制劑大多采用離子抑制-反相HPLC法測定，以外標法計算含量。

反相離子抑制色譜，在流動相中加入冰醋酸，為了抑制ASA的解離，進而消除因色譜柱的吸附而造成拖尾影響，可抑制ASA水解，增加溶液穩(wěn)定性。五、HPLC法ASA栓劑的含量測定

本品含ASA應(yīng)為標示量的90.0%-110.0%。色譜條件：色譜柱ODSC18；流動相為乙腈：四氫呋喃：冰醋酸：水(20:5：5:70);檢測波長276nm。系統(tǒng)適用性試驗：

n＞3000;ASA與SA與內(nèi)標物的R＞1.5具體計算：

Cx=Ax/AR×CR

標示量%=W測/W×W平/標示量×100%

=CR×Ax/AR×D×W平/W/標示量×100%

ChP2010：取本品5粒，精密稱定，置小燒杯中，在40-50度水浴中微溫熔融，在不斷攪拌下冷卻至室溫，精密稱取適量（約相當于阿司匹林0.1g），置50mL量瓶中，加1%冰醋酸的甲醇溶液適量，在40-50度水浴中充分振搖使阿司匹林溶解，放冷，用1%冰醋酸的甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，置冰浴中冷卻1小時，取出，迅速濾過，取續(xù)濾液作為供試品儲備液。精密量取供試品儲備液5mL，置100mL量瓶中，用1%冰醋酸的甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取10uL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取阿司匹林對照品，精密稱定，加1%冰醋酸的甲醇溶液振搖使溶解并定量稀釋制成每1mL中約含0.1mg的溶液，同法測定，按外標法以峰面積計算，即得。

一、血清中ASA和SA濃度的HPLC法

色譜條件：色譜柱為ODS-C18(100mm×4.6mm,5μm)

流動相為0.05%甲酸的乙腈溶液為A，40%10mmol/L甲酸銨溶液為B，60%ASA178.9-136.8；SA136.9-92.8；

內(nèi)標物為4-ABS162.9-118.9。

血清樣品預(yù)處理

血清200μl+HCl50μl+不同濃度ASA和SA+內(nèi)標液加入乙酸乙酯600μl渦旋混合1min，離心5min，取上清