基因表達(dá)研究技術(shù)

基因表達(dá)研究技術(shù)劉亞鵬朱瑞生物工程141班基因表達(dá)研究技術(shù)劉亞鵬朱瑞

生物工程141班轉(zhuǎn)錄組測(cè)序二.RNA選擇性剪接技術(shù)轉(zhuǎn)錄組：一個(gè)活細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)所有RNA的總和（包括mRNA、rRNA、tRNA及非編碼RNA）轉(zhuǎn)錄組學(xué)：是一門在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。簡(jiǎn)而言之，轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達(dá)的情況。一.什么是轉(zhuǎn)錄組及轉(zhuǎn)錄組學(xué)1.表達(dá)序列標(biāo)簽測(cè)序(EST)(1)原理

EST(ExpressedSequenceTag)是從一個(gè)隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5’端和3’端單向一次測(cè)序獲得的短的cDNA部分序列，代表一個(gè)完整基因的一小部分，在數(shù)據(jù)庫(kù)中其長(zhǎng)度一般從20到7000bp不等，平均長(zhǎng)度為360±120bp。EST來(lái)源于一定環(huán)境下一個(gè)組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，因此EST也能說(shuō)明該組織中各基因的表達(dá)水平。二.研究轉(zhuǎn)錄組的方法（2）操作流程組織樣品mRNA的提取→逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA→構(gòu)建cDNA文庫(kù)→測(cè)序

通過(guò)對(duì)cDNA文庫(kù)EST分析可以揭示用以構(gòu)建cDNA文庫(kù)的相應(yīng)組織或細(xì)胞中mRNA的真正水平，因此可以通過(guò)大規(guī)模的EST分析研究表達(dá)圖譜，以此得出特定組織類型在特定生理狀態(tài)或是特定的發(fā)育階段下基因表達(dá)情況。（3）表達(dá)序列標(biāo)簽測(cè)序在轉(zhuǎn)錄組中的運(yùn)用（1）原理

基因表達(dá)系列分析（SAGE）是通過(guò)快速和詳細(xì)分析成千上萬(wàn)個(gè)EST來(lái)尋找出表達(dá)豐富度不同的SAGE標(biāo)簽序列。在此方法中，通過(guò)限制性酶切可以產(chǎn)生非常短的cDNA標(biāo)簽，并通過(guò)PCR擴(kuò)增和連接，隨后對(duì)連接體進(jìn)行測(cè)序。2.基因表達(dá)系列分析（SAGE）a.以biotinylatedoligo(dT）為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以一種限制性內(nèi)切酶（錨定酶）酶切.b.將cDNA等分為A和B兩部分，分別連接接頭A或接頭B。每一種接頭都含有標(biāo)簽酶酶切位點(diǎn)序列.（2）操作程序c.用標(biāo)簽酶酶切產(chǎn)生連有接頭的短cDNA片段，混合并連接兩個(gè)cDNA池的短cDNA片段，構(gòu)成雙標(biāo)簽后，以引物A和B擴(kuò)增d.用錨定酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物，抽提雙標(biāo)簽片段并克隆、測(cè)序.e.對(duì)標(biāo)簽數(shù)據(jù)進(jìn)行處理a.SAGE能夠快速、全范圍提取生物體基因表達(dá)信息，對(duì)已知基因進(jìn)行量化分析。b.SAGE也能應(yīng)用于尋找新基因。（3）.基因表達(dá)系列分析（SAGE）在轉(zhuǎn)錄組研究中的應(yīng)用c.SAGE可用于定量比較不同狀態(tài)下的組織細(xì)胞的特異基因表達(dá)。d.SAGE能夠接近完整地獲得基因組表達(dá)信息，能夠直接讀出任何一種類型細(xì)胞或組織的基因表達(dá)信息。（1）以能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定和一般讀長(zhǎng)較短等為標(biāo)志。對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測(cè)序技術(shù)。3.高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)的誕生可以說(shuō)是基因組學(xué)研究領(lǐng)域一個(gè)具有里程碑意義的事件。該技術(shù)使得核酸測(cè)序的單堿基成本與第一代測(cè)序技術(shù)相比急劇下降,以人類基因組測(cè)序?yàn)槔?上世紀(jì)末進(jìn)行的人類基因組計(jì)劃花費(fèi)30億美元解碼了人類生命密碼,而第二代測(cè)序使得人類基因組測(cè)序已進(jìn)入萬(wàn)(美)元基因組時(shí)代。（1）原理

該技術(shù)系指將大量探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息.包括點(diǎn)陣列基因芯片和原位合成基因芯片。4.基因芯片技術(shù)a.芯片制備目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和點(diǎn)陣列的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。（2）操作流程b.樣品制備生物樣品往往是復(fù)雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應(yīng)，有時(shí)樣品的量很小。所以，必須將樣品進(jìn)行提取、擴(kuò)增，獲取其中DNA或RNA，然后用熒光標(biāo)記，以提高檢測(cè)的靈敏度。c.雜交反應(yīng)

雜交反應(yīng)是熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行的反應(yīng)產(chǎn)生一系列信息的過(guò)程。選擇合適的反應(yīng)條件能使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯(cuò)配率。d.信號(hào)檢測(cè)和結(jié)果分析雜交反應(yīng)后的芯片上各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)的熒光位置、熒光強(qiáng)弱經(jīng)過(guò)芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以分析圖像，將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可以獲得有關(guān)生物信息。

基因芯片以其可同時(shí)、快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計(jì)基因組信息的本領(lǐng)而顯示出了巨大的威力。在基因表達(dá)檢測(cè)的研究上人們已比較成功地對(duì)多種生物包括擬南芥、酵母、人等的基因組表達(dá)情況進(jìn)行了研究，并且用該技術(shù)一次性檢測(cè)了酵母幾種不同株間數(shù)千個(gè)基因表達(dá)譜的差異（3）基因芯片在轉(zhuǎn)錄組研究中的運(yùn)用如：通過(guò)研究酵母從無(wú)氧環(huán)境到有氧環(huán)境時(shí)的表達(dá)譜，以及通過(guò)不同方式處理過(guò)的酵母菌的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)約有5%的基因在表達(dá)量上有明顯的變化。阿爾茨海默病中，出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的大腦神經(jīng)細(xì)胞基因表達(dá)譜就有別于正常神經(jīng)元，當(dāng)病理形態(tài)學(xué)尚未出現(xiàn)纖維纏結(jié)時(shí)，這種表達(dá)譜的差異即可以作為分子標(biāo)志直接對(duì)該病進(jìn)行診斷。

轉(zhuǎn)錄組的研究應(yīng)用于臨床的的另一個(gè)例子是可以將表面上看似相同的病癥分為多個(gè)亞型，尤其是對(duì)原發(fā)性惡性腫瘤，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)譜的建立，可以詳細(xì)描繪出患者的生存期以及對(duì)藥物的反應(yīng)。選擇性剪接的分類一般將選擇性剪接分為：外顯子選擇內(nèi)含子選擇互斥外顯子內(nèi)部剪接位點(diǎn)大多數(shù)真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體是按一種方式剪接產(chǎn)生出一種成熟mRNA分子，因而只翻譯成一種蛋白質(zhì)。有些基因的一個(gè)mRNA前體通過(guò)不同的剪接方式(選擇不同的剪接位點(diǎn))產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體，這一過(guò)程稱為可變剪接。

可變剪接是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機(jī)制,是導(dǎo)致人類基因和蛋白質(zhì)數(shù)量較大差異的重要原因。

RNA選擇性剪接的意義可變剪接被認(rèn)為是導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能多樣性的重要原因之一，它使一個(gè)基因可編碼多個(gè)不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白產(chǎn)物。已有實(shí)驗(yàn)研究表明，可變剪接在產(chǎn)生受體多