原核表達綜述

[Merck推薦]原核表達秘笈之宿主菌株選擇指南在原核蛋白表達過程中，選擇構建一個合適原核表達體系需要綜合考慮3大因素：表達載體、宿主菌株、表達誘導條件，以獲得最滿意的表達效果。事實上，在平時的實驗中，最容易被忽視的就是宿主菌的選擇一一多數(shù)人會直接選擇自己實驗室曾經(jīng)用過的表達菌株，或者是載體配套的菌株，而不去追究原因一一即使表達結果不佳，大多在表達條件和載體上找原因，也不會考究菌株的選擇是否適合。作為原核表達的宿主，對外源基因的表達會產(chǎn)生一定的影響，是勿庸置疑的。每一個宿主細胞都像一個微觀的小工廠，按照細胞固有的程序完成“你給它們安排的生產(chǎn)任務”一一因為很難親眼觀察微觀世界中表達是如何進行的，當出現(xiàn)問題時，我們需要經(jīng)驗判斷問題所在。宿主細胞對原核表達可能會產(chǎn)生哪些影響呢？知其然還要知其所以然。比如，菌株內源的蛋白酶過多，可能會造成外源表達產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達菌株。堪稱經(jīng)典的BL21系列就是10n和ompT蛋白酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表達菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌則是添加T7聚合酶基因，為T7表達系統(tǒng)而設計。真核細胞偏愛的密碼子和原核系統(tǒng)有不同，因此，在用原核系統(tǒng)表達真核基因的時候，真核基因中的一些密碼子對于原核細胞來說可能是稀有密碼子，從而導致表達效率和表達水平很低。改造基因是比較麻煩的做法，Rosetta2系列就是更好的選擇一一這種攜帶PRARE2質粒的BL21衍生菌，補充大腸桿菌缺乏的七種(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG)稀有密碼子對應的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平。(已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質粒)當要表達的蛋白質需要形成二硫鍵以形成正確的折疊時，可以選擇K-12衍生菌Origami2系列，thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase（gor）兩條主要還原途徑雙突變菌株，顯著提高細胞質中二硫鍵形成幾率，促進蛋白可溶性及活性表達。（卡那霉素敏感）Rosetta-gami?2則是綜合上述兩類菌株的優(yōu)點，既補充7種稀有密碼子，又能夠促進二硫鍵的形成，幫助表達需要借助二硫鍵形成正確折疊構象的真核蛋白。（卡那霉素敏感）OrigamiB是衍生自lacZY突變的BL21菌株，這個突變能根據(jù)IPTG的濃度精確調節(jié)表達產(chǎn)物，使得表達產(chǎn)物量呈現(xiàn)IPTG濃度依賴性。（四環(huán)素敏感）在決定試用這些名字古怪的菌株時，有幾個小Tips要注意的，一個是不同菌株有時已經(jīng)攜帶某個質?；蛘咭呀?jīng)具有某種抗生素抗性，要注意自己的表達質粒是否能與之兼容。比如Rosetta2已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質粒，不能再用氯霉素篩選等等?，F(xiàn)象可能原因改進方案建議菌株無蛋白表達E.coli的密碼子偏移性補充稀有密碼子的tRNA；將稀有密碼子突變?yōu)槠胀ù竽c桿菌密碼子Rosetta2Rosetta-gami2Rosetta-gamiBRosettaBlue出現(xiàn)截短蛋白包涵體二硫鍵形成困難降低宿主胞質的還原性；利用促進二硫鍵形成的各種載體標簽Origami2Rosetta-gami2Rosetta-gamiB表達過快，表達量過高蛋白錯誤折疊控制優(yōu)化表達水平：降溫，IPTG濃度優(yōu)化降低宿主胞質的還原性；利用促進二硫鍵形成的各種載體標簽TunerRosetta-gamiBOrigami2Rosetta-gami2Rosetta-gamiB蛋白無活性控制優(yōu)化表達水平：降溫，IPTG濃度優(yōu)化TunerRosetta-gamiB細胞死亡，生長極困難毒性蛋白更嚴格的本底表達控制pLysS菌株無克隆生長過高本底表達更嚴格的本底表達控制pLysS、pLysE菌株原核表達個人秘笈：表達前的分析比什么都重要表達不同于其它一些實驗，比如：提取質粒、PCR、電鏡切片，這些人為控制的因素比較多，出問題相對來說也比較好分析。表達呢，你把質粒克隆好啦，交給細胞，然后有些事情就不全是你要怎樣就怎樣了。原核表達在表達當中來說還是比較簡單，細菌培養(yǎng)條件簡單、生長速度快，需要的儀器和培養(yǎng)基都比較便宜。當然，它也存在一些缺乏高級修飾、細胞內部還原性過高等缺點。原核表達從一開始的設計就非常重要，所謂好的開始是成功的一半。做足準備功夫，可是省去很多將來后悔的事情。首先，我們要根據(jù)是否要求可溶將載體分成兩大類，如果希望可以同時嘗試多種表達系統(tǒng)，也有許多商業(yè)化的系統(tǒng)供選擇。前面已經(jīng)介紹過許多公司的商業(yè)化載體、菌株和多系統(tǒng)表達體系，現(xiàn)在我想先從自己的蛋白分析講起。同樣的載體、同樣的系統(tǒng)，很可能表達這個蛋白表達量奇高，但是另外一個就是做不出來，所以沒有萬能的載體，只有永恒的分析。當然如果你的蛋白曾經(jīng)在原核系統(tǒng)中成功表達出來那是最好的，選擇同樣的載體表達成功率會高很多。如果沒有也最好嘗試找一些曾經(jīng)表達過和你的蛋白擁有相類似結構的文獻。比如大部分含有哺乳動物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列載體表達出來的。根據(jù)經(jīng)驗而言，含有較少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小為60kD的單體蛋白較容易表達。在下面將列出幾個影響表達的因素，大家可以在表達前根據(jù)這幾個因素自己分析一下：.翻譯起始位點現(xiàn)在大部分的表達載體都提供起始位點，所以它已經(jīng)把起始密碼子與核糖體結合位點的距離進行優(yōu)化了，一般情況下不需要自己再加，不過還是要留意載體圖譜上是否注明有起始密碼子和終止密碼子.GC含量表達序列中的GC含量超過70%的時候可能會降低蛋白在大腸桿菌中的表達水平。GC含量可以利用DNASTAR、VectorNTISuite等軟件進行預測。.二級結構在起始密碼子附近的mRNA二級結構可能會抑制翻譯的起始或者造成翻譯暫停從而產(chǎn)生不完全的蛋白。如果利用軟件分析DNA或RNA結構上有柄（stem）結構，并且結合長度超過8個堿基，這種結構會因為位點專一突變等因素而變得不穩(wěn)定。.基因或者蛋白的大小一般說來小于5kD或者大于100kD的蛋白都是難以表達的。蛋白越小，越容易被降解。在這種情況下可以采取串聯(lián)表達，在每個表達單位（即單體蛋白）間設計蛋白水解或者是化學斷裂位點。如果蛋白較小，那么加入融合標簽GST、Trx、MBP或者其它較大的促進融合的蛋白標簽就較有可能使蛋白正確折疊，并以融合形式表達。對于另一個極端，大于60kD的蛋白建議使用較小的標簽，如6義組氨酸標簽。對于結構研究較清楚的蛋白可以采取截取表達。當然表達時要根據(jù)目的進行截取，如果是要進行抗體制備而截取，那么一定要保證截取的部位抗原性較強。對于抗原性也可以利用軟件分析，比如VectorNITSuite或者一些在線軟件，不過在分析之余也要認識到這是一種數(shù)據(jù)統(tǒng)計的結論，如果蛋白和免疫動物親緣關系較遠的話還是不妨一試的。.親疏水性這也是一種經(jīng)驗之談，相信經(jīng)常做表達的人都發(fā)現(xiàn)表達親水區(qū)域時表達量會比較高，如果你要表達一個膜蛋白，那么勸你做好長期抗戰(zhàn)的準備吧。有許多軟件可以對氨基酸的親疏水性進行分析，比如VectorNITSuite，除此之外還可以利用在線跨膜區(qū)預測軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/對跨膜區(qū)進行預測。對于自己表達的蛋白有所了解后就可以開始對載體進行選擇了，目前商業(yè)化的載體基本上包含以下幾個元件：R-regkjlaLotPpromoterR-regkjlaLotPpromoter起始對碼J-SD-Shine-Da^ctrnoseci.uenc€IGmsertgeneTTdranE-criptionaItermin5tarf?BS-ribosornebindingshe除了上面標出的元件外還需要有復制起點，它對于控制質粒的拷貝數(shù)非常重要；另外就是篩選標記了，比如藍白斑篩選的lacZ，各種抗生素標記。在以上幾個元件中，我們需要注意的是負責調節(jié)與啟動的元件，也就是調控子和啟動子。其中啟動子對于蛋白表達的速度起著舉足輕重的作用，它與最終蛋白的表達量、是否可融密不可分。這里，對于世面上廣泛銷售的幾種原核表達載體使用的啟動子進行總結。啟動子來源調控手段（濃度）強度LacUV5乳糖操縱元lacI/IPTG(0.1-1mM)強Trp色氨酸操縱元trpR3-B-吲哚丙烯酸強Tac結合了色氨酸啟動子的-35lacI/IPTG(0.1-1mM)強序列和乳糖啟動子的-10序列-PL入噬菌體入cI阻遏物/溫度強噬菌體T5T5噬菌體lacI/IPTG(0.1-1mM)強pBAD阿拉伯糖操縱元AraBAD/阿拉伯糖（1口m-10mM）嚴謹T7T7RNA聚合酶lacI/IPTG(0.1-1mM)非常強乳糖操縱子是應用最廣泛的調控模式，除了IPTG這種化學誘導方式之外還有利用吲哚丙烯酸和阿拉伯糖的化學誘導。如果你害怕這些化學物質會損害細菌的生長，那么你可以嘗試利用溫度誘導的載體，如：pDH2。它利用PL啟動子，在溫度上升到42℃后進行誘導表達?？梢钥吹皆谒袉幼永飳賂7啟動子最強，它可以將大腸桿菌的資源最大程度地調用過來表達外源蛋白。這樣一些難表達的蛋白都可以在pET系統(tǒng)里面表達出來，但是是不是越強就越好呢？如果你需要表達蛋白是可溶的，那么T7啟動子就不那么適合了。較弱的啟動子轉錄速度較慢，這樣對于表達可溶、穩(wěn)定、完整的蛋白比較有利。Novagen可以說是的pET系統(tǒng)是最王牌的T7啟動子表達系統(tǒng)，可是當T7啟動子的強啟動效應不受歡迎的時候怎么辦呢？在這里給讀者留個小小的疑問，看看大家有沒有仔細看筆者寫的Novagen篇。提示一下，雖然它轉錄速度快，但是可以控制它的拷貝數(shù)，又或者是……利用這些原理Novagen載體也可以毒性高的外源蛋白。載體上除了啟動子這個需要注意之外，另外一個就是標簽了。很多標簽是為了增加蛋白的可溶性，也有一些是為了方便鑒定表達產(chǎn)物，所以在表達時可以選擇加標簽。是否加標簽要看個人需要，筆者認為如果是表達一個人家沒表達過的蛋白最好還是加標簽，這樣方便將來鑒定。如果從經(jīng)濟角度考慮最好加入6義組氨酸標簽，筆者曾經(jīng)以為加什么標簽都無所謂（前提是不需要融合表達），結果加了個Novagen的T7-Tag,等到鑒定的時候發(fā)現(xiàn)單抗那么貴。而且還不好買的，一些較少人用的標簽會讓你很傷腦筋。這也是表達前要準備的功課之一哦。好了，如果你選好了載體，那么下一步就是設計引物的。相信大多數(shù)人都是利用PCR把目的基因調出來的吧。設計引物可以使用一下兩個軟件，PrimerPremier或者Oligo。如果要表達全長，其實也就沒那么多要考慮，從一頭一尾找至少8個匹配序列在加上與載體匹配的序列就可以了。不過，我還是有以下幾點提醒一下各位：.這一點其實很容易理解，但是有時也容易被遺忘。那就是先查查表達外源片段中含有什么內切酶位點，不要設計重了，否則酶切時發(fā)現(xiàn)怎么老是有預期外的小片段出現(xiàn)。.根據(jù)載體上的酶切位點設計引物，現(xiàn)在許多類似T載原理的克隆方法也可以應用到原核表達中了，如果T載克隆方法要定向很多時候要多加4個堿基，設計引物時候可別忘了加。在設計酶切位點的5’端不要忘了加保護堿基，不同內切酶所需的保護堿基不同，Sall不需要保護堿基，EcoRV需要1個，Notl需要2個，Hindlll最好有3個。一般情況下，都設計2個。.注意啟始密碼子和終止密碼子的讀碼框。如果載體上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是緊跟外源片段的，如果中間含有載體序列，務必確定中間這段序列不會造成你外源序列的移碼。按情況需要，可以加1到2個堿基在引物中使讀碼框正確。有始有終，同樣正常的終止密碼子才能保證蛋白的產(chǎn)出。大部分載體也有終止密碼子，如果你對載體的不放心，也可以在引物中設計上終止密碼子，這樣萬無一失。.還有就是設計一對引物需要注意的地方：一對引物之間Tm值相差不宜過大，能一樣最好；一對引物不宜形成發(fā)夾結構、互相配對，若配對時最好不要是G-C的結合（可以用軟件分析）；3'端以G、C結尾為宜等等。如果要詳細研究可以看一下PCR技術的相關書籍，很厚。還有就是記得把上游引物設計成有義鏈，下游設計成反義鏈，否則就沒有片段出現(xiàn)了。雖然這是很小的地方，可是經(jīng)常會被忽略。.如果你是進行截取表達，那么除了之前提到的要注意截取親水區(qū)，還有一點就是對密碼子的使用頻率進行分析。如果在大腸桿菌中使用較少的密碼子在外源片段中連續(xù)出現(xiàn)，還是避開它為上策。因為純化愛上你:原核表達GE（原安瑪西亞）篇講起通用電氣醫(yī)療集團（GEHealthcare）也許生物方面的研究人員會比較陌生，這個從愛迪生的燈泡講起，擁有百年歷史的大集團包括許許多多的行業(yè)（當然也不要盲目崇拜把通用汽車也歸到旗下，GM會生氣的），可是講起蛋白純化等領域首屈一指的安瑪西亞，特別是ECL系列和當年的法瑪西亞的Sepharose、Sephadex等大名鼎鼎的純化填料，那么許多做蛋白的人都很熟悉。美國通用電氣公司2003年10月以總計高達95億美金獲得安瑪西亞公司100%的控股權，這就是轟動一時的儀器行業(yè)內最大的收購案之一。選擇GE的表達載體原因很簡單，愛屋及烏，使用他們的載體可以方便下一步的純化。雖然在這幾篇的介紹中沒有強調純化這個步驟，但是這不是因為純化不重要，而是因為它太重要了。涉及的內容太多，根本可以作為一門學科來了解，所以就不把“戰(zhàn)線”拖那么長了。但是在選擇表達系統(tǒng)的時候，表達后的純化方法是必需考慮的非常重要的問題。之前我們提到的經(jīng)常用于標記的蛋白包括有硫氧還蛋白、6義組氨酸、谷胱甘肽S轉移酶（GST）等，6義組氨酸可以說是被應用的最為廣泛的了，次之就是GE醫(yī)療有專門設計的一系列載體的GST了。GST本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶，它的天然大小為26KD。將它應用在原核表達的原因大致有兩個，一個是因為它是一個高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個是它可以在大腸桿菌中大量表達，起到一種促進表達量提高的作用。6xHistag因為分子量很小且通常認為不會顯著影目標蛋白的活性，在不太嚴謹?shù)膶嶒炛薪?jīng)常不需要切割就可以繼續(xù)分析目標蛋白（嚴格的實驗還是必需切割下來的）。但是GST相比6xHistag分子量要大得多，必需要用蛋白酶將融合蛋白中的GST切下來。對于表達分子量小的目標蛋白來說選擇GST就比6xHistag更有優(yōu)勢一一融合蛋白分子量較大的比較不容易被降解，另外有時天然蛋白里可能存在5個連續(xù)的組氨酸（或者非常靠近的6個His）因而也會被6xHis純化填料吸附而“混入”純化隊伍中，而GST純化填料的專一性則非常高。順帶提一句，GST融合表達得到的包含體經(jīng)過純化后在復性的過程中添加適量的谷胱甘肽明顯有助于提高融合蛋白的復性比率（在還原劑不影響二硫鍵的條件下）。選擇GST載體的同志不可不知。GST系列可是說是GE醫(yī)療在原核表達這塊的王牌產(chǎn)品，總共有13個載體。這13個載體中有9個的多克隆位點是擴展過的，有6個限制性酶切位點。擴展后的多克隆位點方便我們從入噬菌體載體構建的文庫中將所需的基因克隆出來并定向插入到表達載體中。所有載體上都帶有可以將GST切割下來的蛋白酶識別位點，不同載體攜帶的蛋白酶不同，可以分成T系列、X系列和P系列，分別代表采用凝血酶Thrombin、Xa因子蛋白酶以及GE醫(yī)療產(chǎn)的PreScissioM蛋白酶作為蛋白酶切割位點。前面兩個都是非常經(jīng)典的融合表達載體的蛋白酶切割位點，但是由于這兩種蛋白酶切割需時較長而且要求在室溫條件下切割GST,容易導致目標蛋白降解，另外蛋白酶的去除也是比較煩人的問題，所以GE公司就推出了新的系列：PreScission。pGEX-6P-3(27-459M1IPreScission*PrdeaMILeuGitVaiLsliP!ieProlL?nGjySerProAsnSerArrjVaiAgpSeiSerG&AmCTGGAAGTTCTGTICCAGG比CCCCTG^GATCCtCC,GAATTOCGG^TCG^TCGAp￡GGCCGtrBarnHIEwR［防日?Sal3曲由?NotIP系列載體是用PreScissionTM酶進行切割，它的消化溫度只要5°C，可以最大程度減小對目的蛋白的降解作用。因為這個蛋白酶本身通過基因操作也加上了一個GST標記，所以它可以和被切下來的GST殘余部分一起通過谷光甘肽凝膠柱(GlutathioneSepharoseTM)純化去除。這樣就可以極大程度上簡化了純化的步驟，從這里可以再次看出GE醫(yī)療產(chǎn)品在設計上很多時候總是考慮到下一步的純化步驟的。pGEX-6P有三種載體，以方便你從不同的酶切位點插入都不會造成移碼突變。另外值得一提的是PGEX-2TK是專門為了體外標記融合產(chǎn)物以檢測表達情況而設計的。它含有來自心肌的cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位的識別位點，這個位點位于GST和多克隆位點之間。表達的蛋白可以直接用蛋白激酶和[g-32P]ATP進行標記，產(chǎn)物可以用放射自顯影技術穩(wěn)定地檢測。它的GST可以用凝血酶切除?？偟恼f來，pGEX所有載體都提供了三種不同的翻譯讀碼框選擇；都是利用乳糖操縱子調控模式，啟動子都是Ptac。Ptac是由trp啟動子的-35序列和lacUV5的Pribnow序列拼接而成，調控和lac一樣，但是mRNA轉錄水平更高，表達也更高，也都利用IPTG進行誘導表達。IPTG本身有毒而似乎不適合表達醫(yī)藥用途的蛋白。這系列載體都是利用氨芐青霉素進行篩選。其中pGEX-1lT，pGEX-6P-1，pGEX-4T-1和pGEX-5X-1都可以接受來自lgt11文庫的cDNA片斷并進行表達。在表達后的檢測和純化方面，GE醫(yī)療的產(chǎn)品堪稱經(jīng)典。無論是WesternBlot檢測表達，還是五花八門的純化親和層析柱，還有分離凝血酶等絲氨酸蛋白酶的苯甲脒凝膠柱，即使GE醫(yī)療沒有6義組氨酸標記的載體，但是6義組氨酸親和純化相關產(chǎn)品卻絕對出色。極速濃縮、1分鐘洗脫，不同規(guī)格的柱子10月期間一直在特價，詳細情況可參考生物通首頁頭條廣告。這里就不詳細一一介紹了。大家做原核表達的目的是各式各樣的，有用來做抗原；也有需要表達量大,并且需要活性的產(chǎn)物。純化是表達后絕對不可小視的一步。所以，回到開場白“因為純化愛上你”，就是選擇pGEX的最好理由吧！優(yōu)化基因表達的關鍵因素之：基因的重新設計和合在基因表達研究中，研究者比較注意選擇合適的表達載體和宿主系統(tǒng)，而往往忽視基因本身是否與載體和宿主系統(tǒng)為最佳匹配這樣一個實質性問題。基因的最佳化表達可以通過對基因的重新設計和合成來實現(xiàn)，如消除稀有密碼子而利用最佳化密碼子，二級結構最小化，調整GC含量等。以下就密碼子最佳化、翻譯終止效率和真核細胞中異源蛋白表達的問題加以說明。密碼子最佳化(codonoptimization)遺傳密碼有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimalcodons)，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rareorlow-usagecodons)。實際上用做蛋白表達或生產(chǎn)的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細胞，Pichia，植物細胞和昆蟲細胞)都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母、果蠅、靈長類等每種生物都有獨特的8個密碼子極少被利用［1］。有趣的是，靈長類和酵母有6個同樣的利用率低的密碼子。大腸桿菌、酵母和果蠅中編碼豐度高的蛋白質的基因明顯避免低利用率的密碼子。因此，重組蛋白的表達可能受密碼子利用的影響(尤其在異源表達系統(tǒng)中)的事實并不很奇怪。你的基因利用的密碼子可能不是你正在利用的蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)進行高水平表達所偏愛的密碼子，這種情況是可能的。利用偏愛密碼子(preferredcodons)并避免利用率低的或稀有的密碼子可以合成基因，基因的這種重新設計叫密碼子最佳化。在同源表達系統(tǒng)中，同較低水平表達的基因相比，較高表達的基因可能有很不同的密碼子偏愛。通過對密碼子利用的歸類分析，人們可以真正預測任何基因在酵母中的表達水平［2］。在諸如Zeamays的其他生物中，大量高表達基因強烈偏愛以G或C結尾的密碼子［3］。而且，在Dictyostelium中，同低水平表達的基因比較，高表達基因有較大數(shù)目的偏愛密碼子［4］。在大腸桿菌中表達哺乳動物基因是不可預測和具有挑戰(zhàn)的。例如直到最近才實現(xiàn)了人血紅蛋白的過表達［5］。為了達到血紅蛋白的好的表達水平，Alpha-球蛋白cDNA不得不用大腸桿菌偏愛的密碼子進行重新合成。在異源宿主中實現(xiàn)象血紅蛋白這樣復雜的蛋白質的過表達可能需要最佳化密碼子，這些研究者為此提供了令人信服的資料。成簇的低利用率的密碼子抑制了核糖體的運動，這是基因不能以合適水平表達的一個明顯機制。核糖體翻譯由九個密碼子組成的信使（含幾個低利用率密碼子或全部為低利用率密碼子）時的運動速度要比翻譯不含低利用率密碼子的同樣長的信使的速度慢。即使低利用率密碼子簇位于3’端，信使最后也會被核糖體“擁擠”而損害，核糖體又回到5’端。3’端低利用率密碼子簇的抑制效應可以和全部信使都由低利用率密碼子組成的抑制效應一樣大。如果低利用率密碼子簇位于5’端，其效應是起始核糖體數(shù)目的全面減少，導致蛋白合成中信使的低效率。散在分布的稀有密碼子對翻譯的效應還未很好地研究，但是有證據(jù)表明這種情況的確對翻譯效率有負面效應［6］。其他因素也可以影響蛋白表達，包括使mRNA去穩(wěn)定的序列。重新設計合成基因可以去除或改變這些序列，導致高水平表達。消除稀有密碼子、去除任何去穩(wěn)定序列和利用最佳密碼子的基因的重新設計都可能增加蛋白產(chǎn)量，使的蛋白生產(chǎn)