第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能

Chapter3ProteinStructure&FunctionP24,671.Molecularcomponentaminoacid——L--氨基酸

buildingblocks：aminoacidsproteinhydrolysis(acidorbaseorenzyme)NH3+COO-HcarboxylgroupaminogroupsidechainCOMMOMGROUP氨基酸通式CR通式例GlyValAspPro根據(jù)側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)脂肪族氨基酸芳香族氨基酸雜環(huán)氨基酸雜環(huán)亞氨基酸根據(jù)側(cè)鏈的性質(zhì)非極性疏水性氨基酸：Gly、Ala、Val等極性中性氨基酸：Trp、Ser、Tyr等酸性氨基酸：Asp、Glu

堿性氨基酸：Lys、His、Arg

氨基酸的分類(lèi)疏水性氨基酸甘GlyG丙AlaA纈ValV亮LeuL異（亮）IleI苯（丙）PheF脯ProP蛋（甲硫）MetM色TrpT親水性氨基酸絲SerS蘇ThrT天胺AsnN谷胺GlnQ酪TyrY半（胱）CysC酸性氨基酸天（冬）AspD谷GluE堿性氨基酸賴(lài)

LysK精ArgR組HisH

氨基酸表示法－中文、三字符號(hào)和單字符號(hào)p16一個(gè)氨基酸的-羧基與另一個(gè)氨基酸的-氨基之間脫水縮合形成的化學(xué)鍵。Connectiontypeofammoniaacid

peptidebone（肽鍵）CH+H3NR1COO-+-H2OCHNR2COO-HHH+CH+H3NR1COO-CHNR2COHpeptidebone鍵長(zhǎng)為0.132nm,介于單鍵（鍵長(zhǎng)為0.147nm）與雙鍵（鍵長(zhǎng)為0.128nm）之間。具雙鍵的性質(zhì)，即不能旋轉(zhuǎn)。Featuresofpeptidebond－NH3＋-COO-7.23A3.61AComponentsofapolypeptidechain.Apolypeptidechainconsistsofaconstantbackbone(showninblack)andvariablesidechains(showningreen).肽鏈：主鏈（backbone）+側(cè)鏈（sidechain）由氨基酸殘基組成，其連接鍵為肽鍵方向性:含有氨基末端（N-端）、羧基末端（C-端）肽鏈骨架為:…-N-C-C-N-C-C-…側(cè)鏈（R）決定其排列順序肽鏈的特點(diǎn)肽平面——肽單元（peptideunit)上世紀(jì)30年代末，L.Pauling和R.B.Corey應(yīng)用X線衍射技術(shù)研究氨基酸和寡肽的晶體結(jié)構(gòu)，提出肽單元。參與構(gòu)成肽鍵的6個(gè)原子（C1、C、O、N、H、C2)被約束在同一個(gè)平面上，C1和C2處平面對(duì)角，這樣的平面單位稱(chēng)為肽平面。肽平面肽平面-1肽平面-2多肽鏈可以看成由Cα串聯(lián)起來(lái)的無(wú)數(shù)個(gè)肽平面組成2MolecularStructure

一級(jí)結(jié)構(gòu)（初級(jí)結(jié)構(gòu)）空間結(jié)構(gòu)（高級(jí)結(jié)構(gòu)）二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象（conformation)：指一類(lèi)不涉及共價(jià)鍵改變的立體結(jié)構(gòu)問(wèn)題。如蛋白質(zhì)的一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)。構(gòu)型（configuration)：指一類(lèi)涉及共價(jià)鍵改變的立體結(jié)構(gòu)問(wèn)題。如氨基酸的L-型和D-型。指多肽鏈中氨基酸的排列順序稱(chēng)為蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。維系一級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵：肽鍵（主鍵）Primarystructure牛胰核糖核酸酶一級(jí)結(jié)構(gòu)：一條肽鏈124個(gè)氨基酸殘基，缺色氨酸四個(gè)二硫鍵胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)：兩條肽鏈，A鏈和B鏈51個(gè)氨基酸殘基3個(gè)二硫鍵Proteinspacestructure空間結(jié)構(gòu)的表示方法：金屬絲模型主鏈金屬絲模型Backbonewiremodel飄帶模型Ribbonmodel香腸模型Sausagemodel空間填充模型Space-fillingmodel指多肽鏈主鏈以肽平面為單位折疊形成局部肽段的空間排布方式。即主鏈原子的局部空間排布（即構(gòu)象），并不涉及側(cè)鏈部分的位置。

維系二級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵：氫鍵（次級(jí)鍵）二級(jí)結(jié)構(gòu)的形式：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲。SecondarystructureSeveraltypesofsecondarystructureareparticularlystableandoccurwidelyinproteins.Themostprominentaretheαhelixandβconformationsdescribedbelow.Usingfundamentalchemicalprinciplesandafewexperimentalobservations,LinusPaulingandRobertCoreypredictedtheexistenceofthesesecondarystructuresin1951,severalyearsbeforethefirstcompleteproteinstructurewaselucidated.定義：蛋白質(zhì)分子中局部肽鏈的肽平面通過(guò)α碳原子旋轉(zhuǎn)，使碳鏈主鏈沿中心軸盤(pán)曲成穩(wěn)定的右手螺旋構(gòu)象α螺旋是主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)形式，存在于大多數(shù)的蛋白質(zhì)中，如α角蛋白（皮膚、毛發(fā)、指甲、和角）全部是α螺旋-螺旋（-helix)-螺旋（-helix)模型圖5.4A3.6個(gè)殘基氫鍵側(cè)鏈基團(tuán)Fourmodelsoftheahelix,showingdifferentaspectsofitsstructure.

(a)Formationofaright-handedαhelix.Theplanesoftherigidpeptidebondsareparalleltothelongaxisofthehelix.(b)Ball-and-stickmodelofaright-handedαhelix,showingtheintrachainhydrogenbonds.Therepeatunitisasingleturnofthehelix,3.6residues.(c)Theαhelixasviewedfromoneend,lookingdownthelongitudinalaxis.NotethepositionsoftheRgroups,representedbyredspheres.(d)Aspace-fillingmodeloftheαhelix.α-螺旋的要點(diǎn)：

一般為右手螺旋；

每個(gè)螺旋圈含3.6個(gè)氨基酸殘基，螺距為0.54nm;

螺旋圈之間通過(guò)氫鍵（aa1的C=O和aa4的-NH之間）維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定;

R側(cè)鏈位于螺旋外側(cè)，其大小、形狀及電荷等是影響此結(jié)構(gòu)形成的主要因素。Hairα-keratinisanelongatedaα-helixwithsomewhatthickerdomainsneartheaminoandcarboxytermini.Pairsofthesehelicesareinterwound,probablyinaleft-handedsense,toformtwo-chaincoiledcoils.例1Structureofcollagen.(膠原質(zhì)）Thecollagenhelixisarepeatingsecondarystructureuniquetothisprotein.(a)TherepeatingtripeptidesequenceGly-X-ProorGly-X-Hypadoptsaleft-handedhelicalstructurewiththreeresiduesperturn.TherepeatingsequenceusedtogeneratethismodelisGly-Pro-Hyp.(b)Space-fillingmodelofthecollagenhelixshownin(a).(c)Threeoftheseheliceswraparoundoneanotherwitharight-handedtwist.Theresultingthree-strandedmoleculeisreferredtoastropocollagen.(d)Thethree-strandedcollagensuperhelixshownfromoneend,inaball-and-stickrepresentation.Glycineresiduesareshowninred.Glycine,becauseofitssmallsize,isrequiredatthetightjunctionwherethethreechainsareincontact.例2定義：多肽鏈的局部肽段，以肽鍵平面為單位折疊成鋸齒狀的一種較伸展結(jié)構(gòu).-折疊（-pleatedsheet)-折疊（-pleatedsheet)模型圖CαAtwisted

sheet.(A)Aball-and-stickmodel.(B)Aschematicmodel.(C)Theschematicviewrotatedby90degreestoillustratethetwistmoreclearly.片層并非是平直而是扭曲的β-折疊的要點(diǎn)：多肽鏈較伸展,遇Cα發(fā)生折疊,R側(cè)鏈交錯(cuò)位于鋸齒狀(hackle)結(jié)構(gòu)上下方；兩條或多條肽鏈片段平行排列，靠鏈間氫鍵穩(wěn)定構(gòu)象（-CO和-NH）；兩條肽鏈的走向可以是順向平行或反向平行（殘基間距離前者為0.65nm，后者為0.70nm）或混合排列。-轉(zhuǎn)角（-turn)定義：多肽鏈中的某局部出現(xiàn)180度回折處形成的特定構(gòu)象。一般由四個(gè)氨基酸組成，常見(jiàn)氨基酸：Pro,Gly,Asp,Asn,Trp。以氫鍵維持穩(wěn)定，第1個(gè)氨基酸殘基的C=O與第4個(gè)殘基的N-H之間形成氫鍵。賦予蛋白質(zhì)較大的構(gòu)象柔性，常位于三維結(jié)構(gòu)的表面，有些具有特定功能。β-轉(zhuǎn)角(β-turnorreverseturnorhairpinbend)Structureofareverseturn.TheCOgroupofresidueiofthepolypeptidechainishydrogenbondedtotheNHgroupofresiduei+3tostabilizetheturn.無(wú)規(guī)則卷曲（randomcoil）定義：沒(méi)有明確規(guī)律性的那部分肽段的結(jié)構(gòu)。但這些“無(wú)規(guī)則卷曲”也象其他二級(jí)結(jié)構(gòu)那樣是明確而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。即蛋白質(zhì)在其多肽鏈的不同區(qū)段可形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)。作用：賦予蛋白質(zhì)較大的構(gòu)象柔性，常構(gòu)成蛋白質(zhì)的特定功能部位。定義：即模體（motif）是指在多肽鏈內(nèi)順序上相互靠近的二級(jí)結(jié)構(gòu)常常在空間折疊中彼此相互作用，形成規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)聚合體。作用：它是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的一個(gè)層次，具有特定功能故稱(chēng)超二級(jí)結(jié)構(gòu)。通常類(lèi)型有：、、（三）超二級(jí)結(jié)構(gòu)(supersecondarystructure)和結(jié)構(gòu)域(domain)超二級(jí)結(jié)構(gòu)Motif的常見(jiàn)組合結(jié)構(gòu)域定義：是指在較大蛋白質(zhì)分子中，由于多肽鏈上相鄰的超二級(jí)結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系，形成二個(gè)或多個(gè)在空間上可以明顯區(qū)別的局部區(qū)域（一般為球狀），常具有特定的功能。有時(shí)也稱(chēng)功能域（functionaldomain）。結(jié)構(gòu)域約含100-200個(gè)氨基酸殘基，各自有獨(dú)特的空間構(gòu)象，并承擔(dān)不同的生物學(xué)功能。結(jié)構(gòu)域的特征：結(jié)構(gòu)域50-350個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，與整個(gè)蛋白質(zhì)分子是共價(jià)相連，蛋白質(zhì)分子可以有多個(gè)相同或不同結(jié)構(gòu)域的組合。多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域常有它對(duì)應(yīng)的基因外顯子編碼。是多肽鏈的獨(dú)立折疊單位，結(jié)構(gòu)域之間常有一段柔性的肽鏈連接（鉸鏈區(qū)，hinge），使結(jié)構(gòu)域容易發(fā)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)。結(jié)構(gòu)域承擔(dān)一定的生物學(xué)功能，幾個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，可體現(xiàn)出蛋白質(zhì)的總體功能。例如，脫氫酶類(lèi)的多肽主鏈有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)為NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是起催化作用的結(jié)構(gòu)域，兩者組合成脫氫酶的脫氫功能區(qū)。結(jié)構(gòu)域之間有一裂溝（cleft）或口袋狀，常常是活性部位。定義：指在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽鏈進(jìn)一步卷曲、折疊而形成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)是一條多肽鏈的完整的構(gòu)象，包括全部的主鏈和側(cè)鏈的專(zhuān)一性的空間排布。維系三級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵：氫鍵、疏水鍵、鹽鍵和范德華力等次級(jí)鍵以及二硫鍵。tertiarystructureMyohemerythrin(2mhrintheProteinDataBank)isanoxygen-carryingproteinfromasipunculanworm.Thefour-helix,up-and-downbundlemotifiscommontoanumberoffunctionallyunrelatedproteins.Thiscommonalityindicatesthatthisisanenergeticallyfavorablearrangement.蚯蚓肌紅蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋）激酶相關(guān)蛋白半乳糖苷變旋酶三級(jí)結(jié)構(gòu)（β-折疊）氧化鐵還原蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)半乳糖苷激酶三級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊）定義：指具有二條或二條以上獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，其多肽鏈間通過(guò)次級(jí)鍵相互結(jié)合，而形成空間結(jié)構(gòu)。亞基（subunit）：四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白中，具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈。故四級(jí)結(jié)構(gòu)實(shí)際是亞基的立體排列和相互作用。作用力：疏水鍵、離子鍵、氫鍵Quaternarystructure）QuaternarystructureofhemoglobinHemoglobiniscomposedoffourpoly-peptidechains,eachofwhichisboundtoahemegroup.Thetwoαchainsandthetwoβchainsareidentical.Hemeprostheticgroups(1persubunit,so4perHbtetramer)inred(ball&stickrendering)--the4hemesarefarapart.八聚體組蛋白核心2(H2A,H2B,H3,H4)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的總結(jié)一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)趨向形成一種能量最低，結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，這是蛋白質(zhì)能折疊的動(dòng)力；細(xì)胞內(nèi)高稠密介質(zhì)，以及狹窄空間使得伸展的和部分折疊的蛋白質(zhì)在高濃度時(shí)傾向于聚集；無(wú)法自我迅速完成正確折疊；“輔助性組裝學(xué)說(shuō)”（assistedassembling）：新生肽鏈折疊并組裝成有功能的蛋白質(zhì)并非都能自發(fā)完成，在相當(dāng)多的情況下是需要其他蛋白質(zhì)幫助的，這類(lèi)幫助蛋白包括分子伴侶（molecularchaperones）和折疊酶（foldingenzymes,foldases）。蛋白質(zhì)的折疊問(wèn)題兩大類(lèi)蛋白質(zhì)參與蛋白質(zhì)折疊：折疊酶：蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（proteindisulfideisomerase,PDI）:加速蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中形成正確配對(duì)二硫鍵；肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶（peptidyl

prolyl

cis/transisomerase,PPI）分子伴侶（molecularchaperone）:為蛋白質(zhì)折疊提供一個(gè)有利的折疊環(huán)境，與未折疊肽段的疏水部分可逆結(jié)合，防止聚集和錯(cuò)誤折疊，誘導(dǎo)正確折疊。如熱休克蛋白（heatshockprotein）等1987,Lasky:molecularchaperone分子伴侶主要的分類(lèi)：伴侶素家族（chaperonin,Cpn）應(yīng)激蛋白70家族（stress-70family）/熱休克蛋白70家族（Hsp70family）應(yīng)激蛋白90家族（stress-90family）/熱休克蛋白90家族（Hsp90family）伴侶素家族（chaperonin,Cpn）Thestructureandfunctionofthehsp60familyofmolecularchaperones.(A)Thecatalysisofproteinrefolding.Asindicated,amisfoldedproteinisinitiallycapturedbyhydrophobicinteractionsalongonerimofthebarrel.ThesubsequentbindingofATPplusaproteincapincreasesthediameterofthebarrelrim,whichmaytransientlystretch(partlyunfold)theclientprotein.Thisalsoconfinestheproteininanenclosedspace,whereithasanewopportunitytofold.Afterabout15seconds,ATPhydrolysisejectstheprotein,whetherfoldedornot,andthecyclerepeats.Thistypeofmolecularchaperoneisalsoknownasachaperonin;itisdesignatedashsp60inmitochondria,TCP-1inthecytosolofvertebratecells,andGroELinbacteria.Asindicated,onlyhalfofthesymmetricalbarreloperatesonaclientproteinatanyonetime.(B)ThestructureofGroELboundtoitsGroEScap,asdeterminedbyx-raycrystallography.Ontheleftisshowntheoutsideofthebarrel-likestructureandontherightacrosssectionthroughitscenter.Thehsp70familyofmolecularchaperones.Theseproteinsactearly,recognizingasmallstretchofhydrophobicaminoacidsonaprotein'ssurface.Aidedbyasetofsmallerhsp40proteins,anhsp70monomerbindstoitstargetproteinandthenhydrolyzesamoleculeofATPtoADP,undergoingaconformationalchangethatcausesthehsp70toclampdownverytightlyonthetarget.Afterthehsp40dissociates,thedissociationofthehsp70proteinisinducedbytherapidre-bindingofATPafterADPrelease.Repeatedcyclesofhspproteinbindingandreleasehelpthetargetproteintorefold,應(yīng)激蛋白70家族(Stress-70family）3Relationshipbetweenstructureandfunction

一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，功能不同；一級(jí)結(jié)構(gòu)相似，空間構(gòu)象和功能也相似例１activitynoactivity例２分子病DNA……TGTGGGCTTCTTTTT……正常mRNA……ACACCC

GAAGAAAAA……

HbA（亞基）N…—Thr—Pro—Glu

—Glu—Lys—…DNA……TGTGGGCAT

CTTTTT……異常mRNA……ACACCCGUAGAAAAA……

Hbs（亞基）N…—Thr—Pro—Val—Glu—Lys—…鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血的血紅蛋白的異常鐮刀形紅細(xì)胞貧血現(xiàn)是由于血紅蛋白發(fā)生了遺傳突變引起的鏈第6位的aa線基由正常的Glu變成了疏水性的Val一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化同源蛋白質(zhì)：在不同的生物體內(nèi)行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。

如：血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能，細(xì)胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分。通過(guò)比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化。

親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大；反之，就越小。一些哺乳動(dòng)物胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)的差異名稱(chēng)A8

A9A10B30與人的差異數(shù)活性人蘇氨酸絲氨酸異亮氨酸蘇氨酸-

豬--

丙氨酸1

抹香鯨--

丙氨酸1

馬-甘氨酸

丙氨酸2↓象-甘氨酸纈氨酸

2↓牛丙氨酸-纈氨酸丙氨酸3↓例１不同生物和人的細(xì)胞色素c中氨基酸組成的差異生物名稱(chēng)不同氨基酸數(shù)生物名稱(chēng)不同氨基酸數(shù)黑猩猩0恒河猴1豬、牛、羊10馬12雞13海龜15金槍魚(yú)21小蠅25小麥35酵母44例２細(xì)胞色素C的一級(jí)結(jié)構(gòu)與物種進(jìn)化間的關(guān)系物種進(jìn)化樹(shù)（phylogenetictree）蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)功能；蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)相似其功能也相似；蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能改變，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象?。旱鞍踪|(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系構(gòu)象病構(gòu)象?。旱鞍踪|(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有改變，而由蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變而影響其功能，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致疾病。瘋牛?。河呻貌《镜鞍祝╬rion

protein,PrP）引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性疾病，具有傳染性、遺傳性和散發(fā)的特點(diǎn)。NormalfoldingpatternofPrPAlternativefoldingpatternofPrP朊病毒蛋白?核酸組成單位種

類(lèi)連接方式一級(jí)結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)功能蛋白質(zhì)兩種重要的生物大分子比較氨基酸核苷酸20種A、C、G、T(DNA)A、C、G、U(RNA)肽鍵磷酸二酯鍵AA排列順序堿基序列二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋、超螺旋、蛋白-核酸非共價(jià)結(jié)合生命活動(dòng)直接執(zhí)行者遺傳信息貯存、傳代、表達(dá),決定蛋白結(jié)構(gòu)4PrimaryProperty（1）變性

天然蛋白質(zhì)的嚴(yán)密結(jié)構(gòu)在某些理化因素的作用下，其特定的空間結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致質(zhì)理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性喪失。變性本質(zhì):空間構(gòu)象的改變或破壞,不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變和肽鍵斷裂主要理化性質(zhì)1、蛋白質(zhì)的變性（denaturation）和復(fù)性穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的作用力氫鍵鹽鍵二硫鍵FoodvsProtein角蛋白變性？燙發(fā)原理（2）復(fù)性

若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，有些蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能。

2、紫外吸收性質(zhì)：蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵色氨酸、酪氨酸，在280nm處有特征吸收峰。利用此特點(diǎn)可用分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量（在波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的OD280與其濃度成正比關(guān)系），也可粗略估計(jì)核酸中蛋白質(zhì)污染程度(A260/A280)。應(yīng)用：測(cè)定生物樣品中蛋白質(zhì)的含量5IsolationandPurification鹽析、透析、電泳、層析和超速離心等溫和的物理方法提取不含雜蛋白的單一蛋白質(zhì)，測(cè)定氨基酸組成，分析氨基酸順序，通過(guò)X射線衍射等方法確定空間結(jié)構(gòu)。一、超速離心（ultracentrifugation）原理：蛋白質(zhì)在高達(dá)50萬(wàn)g的重力作用下，在溶液中逐漸沉降，直至其浮力與離心所產(chǎn)生的力相等，此時(shí)沉降停止。不同蛋白質(zhì)其密度與形態(tài)各不相同，因此用上述方法可以將它們分開(kāi)。種類(lèi)：差速離心、密度梯度區(qū)帶離心等。差速離心(differentialcentrifugation)

溶液在不同的速度下離心，從而分離和收集大小不同的蛋白質(zhì)顆粒。密度梯度區(qū)帶離心(densitygradientzonalcentrifugation)〔

速率區(qū)帶離心(rate-zonalcentrifugation)〕密度梯度(densitygradient)：密度隨距離不同而改變，尤其指在試管或小室中，溶液的密度從一端向另一端改變。密度梯度離心(densitygradientzonalcentrifugation)：為了制備或分析，將大分子通過(guò)密度梯度進(jìn)行離心的方法。氯化銫梯度離心(cesiumchloridegradient):又稱(chēng)為等密度梯度離心，將含有大分子的氯化銫鹽溶液進(jìn)行離心，在氯化銫的分布達(dá)到平衡后，容器中形成密度梯度，大分子在與其密度相等的梯度處形成帶，從而達(dá)到分離的目的。蔗糖密度梯度(sucrosedensitygradient)：用不同濃度的蔗糖溶液配制的密度梯度（5%-25%）。lowhighsucrosecocktail蔗糖密度梯度二、電泳（electrophoresis）原理：蛋白質(zhì)在高于或低于其等電點(diǎn)（pI）的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。通過(guò)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的目的。種類(lèi)：薄膜電泳、凝膠電泳等。PNH2COO-NH3+NH3+COOHCOO-PP+OH-+H++H++OH-兼性離子（pI）陽(yáng)離子陰離子蛋白質(zhì)的兩性離解電場(chǎng)電場(chǎng)凝膠電泳－SDSSDS－十二烷基磺酸鈉：攜帶負(fù)電荷，覆蓋在蛋白質(zhì)表面，使其分子間的電荷差異消失。PAGE－聚丙烯酰胺凝膠：分子篩效應(yīng)。用途：常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。Electrophoresis-SDS(a)Differentsamplesareloadedinwellsordepressionsatthetopofthepolyacrylamidegel.Theproteinsmoveintothegelwhenanelectricfieldisapplied.Thegelminimizesconvectioncurrentscausedbysmalltemperaturegradients,anditminimizesproteinmovementsotherthanthoseinducedbytheelectricfield.(b)ProteinscanbevisualizedafterelectrophoresisbytreatingthegelwithastainsuchasCoomassieblue,whichbindstotheproteinsbutnottothegelitselfEachbandonthegelrepresentsadifferentprotein(orproteinsubunit);smallerproteinsarefoundnearerthebottomofthegel.ThisgelillustratesthepurificationoftheenzymeRNApolymerasefromthebacteriumE.coli.Thefirstlaneshowst