流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用(高艷紅)

流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用

（FlowCytometry,FCM)解放軍總醫(yī)院生化科高艷紅1、流式細(xì)胞儀(FlowCytometer):是集光電子物理，光電測量，計(jì)算機(jī)，細(xì)胞熒光化學(xué)，單抗技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。2、流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry):利用流式細(xì)胞儀對處于快速流動的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速（每秒可達(dá)1000-10000個(gè)）的定量分析和分選（純度可達(dá)99%以上）的技術(shù)。基本概念EPICSXL流式細(xì)胞儀電源箱自動進(jìn)樣器流式細(xì)胞儀主機(jī)流式細(xì)胞儀工作站流式細(xì)胞儀的基本原理流式細(xì)胞儀的應(yīng)用流式細(xì)胞儀的操作內(nèi)容流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)

流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng):鞘液激光光源及光束形成系統(tǒng):透鏡、濾光片、小孔，聚焦光源光電管和檢測系統(tǒng)：收集不同波長的熒光信號，光電倍增管（PMT）、補(bǔ)償電路，熒光信號轉(zhuǎn)換為電信號，并將信號放大計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)流式細(xì)胞儀的主要技術(shù)指標(biāo)1．流式細(xì)胞儀的分析速度：

一般流式細(xì)胞儀每秒檢測1000～

5000個(gè)細(xì)胞,大型機(jī)可達(dá)每秒上萬個(gè)細(xì)胞。2．流式細(xì)胞儀的熒光檢測靈敏度：一般能測出單個(gè)細(xì)胞上<600個(gè)熒光分子,兩個(gè)細(xì)胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分。3．前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：前向角散射（FSC）反映被測細(xì)胞的大小,一般流式細(xì)胞儀能夠測量到0.2μm～０.5μm。4．流式細(xì)胞儀的分辨率：通常用變異系數(shù)CV值來表示，,一般流式細(xì)胞儀能夠達(dá)到<2.0%,這也是測量標(biāo)本前用熒光微球調(diào)整儀器時(shí)要求必須達(dá)到的。5．流式細(xì)胞儀的分選速度：一般流式細(xì)胞儀分選速度＞1000個(gè)/秒，分選細(xì)胞純度可達(dá)99%以上。

流動室（flowcell）InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid光路激光 根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定

濾片長通濾片

–

允許長于設(shè)定波長的光通過短通濾片–

允許短于設(shè)定波長的光通過帶通濾片–

允許一定帶寬的波長的光通過帶阻濾片–

阻擋一定帶寬的波長的光通過二向色性濾片(dichroicfilter)：當(dāng)以45o

角放置濾片時(shí),該濾片可以通過一定波長的光,同時(shí)也可以阻斷并折射該波長以下的光。

常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅PI488620DNA染色橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC633 670PMTPMTPMTPMT4DichroicFiltersBandpassFiltersFlowCytometryPrincipleLaser1234Flowcell檢測信號散射光信號

FS:前向角散射光

SS:側(cè)向角散射光(90度散射光)熒光信號熒光染料光學(xué)濾片

散射光信號—前向散射光(FS)FSForward(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的檢測器,為前向散射光檢測器FS的強(qiáng)度主要與細(xì)胞或其他顆粒的大小有關(guān)FALSSensorLaser前向散射光

散射光信號–側(cè)向散射光SS-Side(AngelLight)Scatter

與激光束垂直方向的檢測器為側(cè)向檢測器,也稱為90度散射光檢測器SS反映被測細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核膜的折射率和細(xì)胞內(nèi)顆粒的性狀，SS的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的顆粒度有關(guān)FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散射光熒光染料比較(平均熒光強(qiáng)度)

Q-Prep/ImmunoPrep試劑系統(tǒng)PerCP<APC<FITC<ECD<PC5<PECD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APC

二、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞增殖周期測定和DNA倍體分析凋亡檢測免疫功能的檢測血液學(xué)應(yīng)用HLA-B27的檢測：用于診斷強(qiáng)直性脊柱炎其他：溶液中細(xì)胞因子的測量細(xì)胞分選

細(xì)胞增殖周期測定和DNA倍體分析1）細(xì)胞增殖周期：分為G0、G1、S、G2、M期。FCM分析一個(gè)群體細(xì)胞峰DNA倍體與細(xì)胞周期時(shí)，將DNA含量直方圖分為三部分，即G0/G1,S,G2/M期三個(gè)細(xì)胞峰。G0/G1和G2/M細(xì)胞峰DNA的含量成正態(tài)分布，S期細(xì)胞峰則是一個(gè)加寬的正態(tài)分布。2）利用DNA的熒光染料，如PI（Propidiumiodide碘化丙啶），與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，可反映細(xì)胞內(nèi)DNA含量。采用DNA直方圖顯示。具有2CDNA含量細(xì)胞為G0/G1期細(xì)胞，4CDNA含量細(xì)胞為G2/M期細(xì)胞，DNA含量介于兩者之間的細(xì)胞為S期細(xì)胞。3）DNA倍體：主要比較G0/G1期細(xì)胞DNA含量的變化。用DNA指數(shù)（DI）表示。DNA指數(shù)=測量樣本G0/G1期DNA含量/正常人淋巴細(xì)胞G0/G1期DNA含量以正常人淋巴細(xì)胞作為對照。正常細(xì)胞DNA指數(shù)為1.00，DNA指數(shù)＞1，為超2倍體，＜1為亞2倍體，兩者可統(tǒng)稱為非整倍體。非整倍體細(xì)胞中腫瘤的特異性標(biāo)志，實(shí)體腫瘤中出現(xiàn)頻率較高。凋亡檢測1）FCM-DNA檢測（DNA亞G1峰的檢測）：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。其原理為在凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標(biāo)本制備中的固定處理時(shí)，細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)降解的DNA片段從細(xì)胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。注：檢測的凋亡細(xì)胞數(shù)代表晚期的凋亡細(xì)胞比例，且易受標(biāo)本中的死細(xì)胞和碎片的干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。2）DNA鏈損傷“TUNEL”法3）Annexin-V-FITC/PI雙染法4）線粒體細(xì)胞膜電位的檢測5）凋亡相關(guān)基因的檢測——免疫標(biāo)記法檢測基因免疫功能的檢測（1）利用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，對PB中淋巴細(xì)胞比例，及淋巴細(xì)胞中T、B、NK細(xì)胞的比例，及T細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測。如CD3+（總T細(xì)胞）；CD19+（總B細(xì)胞），CD3-/（CD16+5（NK細(xì)胞）。3+/CD4+（Th/Ti）：輔助/誘導(dǎo)；CD3+/CD4+/CD5RA+：na?ve輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞；CD3+/CD4+/CD45R0+：記憶性輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞；D3+/CD8+（Ts/Tc）：抑制/殺傷；CD3+/CD8/45RA+：na?ve抑制/殺傷T細(xì)胞；CD3+/CD8+/CD45R0+：記憶性抑制/殺傷T細(xì)胞。胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測：CD4+/IL-4+，Th1細(xì)胞，CD4+/IFN-γ+。（2）臨床應(yīng)用：原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細(xì)胞增殖病、腫瘤療效觀察與預(yù)后判斷、移植免疫檢測等。是白細(xì)胞（包括血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞等）在正常分化成熟的不同階段以及活化過程中在這些不同譜系（lineage）細(xì)胞胞漿或細(xì)胞膜表面出現(xiàn)或消失的標(biāo)記，參與機(jī)體重要的生理和病理過程。八十年代在WHO和國際免疫學(xué)聯(lián)合會(IUIS)組織下，將識別同一分化抗原的來自不同實(shí)驗(yàn)室的單克隆抗體歸為一個(gè)分化群.白細(xì)胞分化抗原-CD分子(Clusterofdifferentiation)

CD抗原及其相關(guān)細(xì)胞群

細(xì)胞群CD抗原

T細(xì)胞CD2CD3CD4CD5CD7CD8CD28CD38B細(xì)胞CD10CD19CD20-CD24CD37CD72-CD75

髓系細(xì)胞CD13CD14CD15-CD17CD33CD34CD35NK細(xì)胞CD16CD56CD57CD94

血小板CD31CD41CD42aCD42bCD61CD62pCD63

激活抗原CD26CD30CD69CD95-CD97

粘附分子CD11a-cCD18CD29CD44CD49a-f

內(nèi)皮細(xì)胞CD105CD106CD109細(xì)胞因子受體CD25CD115CD117CD122CD126

1.評價(jià)機(jī)體的免疫功能(1)淋巴細(xì)胞亞群

T細(xì)胞：CD3+CD4+(Th/Ti)CD8+(Ts/Tc)B細(xì)胞：CD19+NK細(xì)胞：CD3-CD16+CD56+(2)淋巴細(xì)胞亞群細(xì)分

T細(xì)胞：Ts：CD8+CD28-Tc：CD8+CD28+Th：CD4+CD29+Ti：CD4+CD45RA+B細(xì)胞：B1：CD5+CD19＋B2：CD5－

CD19+

CD4+:Th1:CD4+IFNr+Th2:CD4+IL4+Th0:CD4+IFNr+IL4+

CD8+:Tc1:CD8+IFNr+Tc2:CD8+IL4+Tc0:CD8+IFNr+IL4+根據(jù)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的不同分為輔助性T細(xì)胞亞群的生物學(xué)功能及臨床意義Th1細(xì)胞：介導(dǎo)細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的生長和活化、巨噬細(xì)胞的活化、介導(dǎo)遲發(fā)型過敏反應(yīng)。其功能亢進(jìn)將導(dǎo)致炎癥慢性遷延，器官特異性自身免疫病，急性排異反應(yīng)和接觸性皮炎等的發(fā)病和免疫病理損傷。Th2細(xì)胞：介導(dǎo)體液免疫，促進(jìn)B細(xì)胞的生長、活化和分化，是IgG1和IgE類抗體的轉(zhuǎn)換因子，其功能亢進(jìn)將導(dǎo)致特異性過敏反應(yīng)，參與高IgE綜合癥和嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。Th1/Th2細(xì)胞平衡偏移多見于：感染癥、自身免疫病、過敏癥、排斥反應(yīng)、免疫缺陷、腫瘤惡化等。檢測Th1/Th2細(xì)胞平衡主要是分析疾病發(fā)生發(fā)展的狀況，為臨床調(diào)整Th1/Th2細(xì)胞平衡偏提供正確的治療依據(jù)。

(3)活化淋巴細(xì)胞亞群

活化總T細(xì)胞：

CD3+/HLA—DR+

早期活化T細(xì)胞（CD4/CD69/CD8）

活化T細(xì)胞（CD25/CD3）

活化T細(xì)胞亞群（CD4/CD25/CD8）

或（CD4/HLA-DR/CD8）HLA-DR、CD69、CD25是T細(xì)胞活化各個(gè)時(shí)期表達(dá)的標(biāo)志性抗原，對其進(jìn)行檢測可以判斷出疾病的進(jìn)程，有助于臨床疾病的輔助診斷、預(yù)后和治療(8)機(jī)體免疫功能監(jiān)測的應(yīng)用自身免疫性疾病HLA-B27:強(qiáng)直性脊柱炎相 關(guān)標(biāo)志變態(tài)反應(yīng)性疾病CD23:與變態(tài)反應(yīng)嚴(yán)重程度 呈正相關(guān)免疫缺陷性疾病感染性疾病(病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染)

免疫治療監(jiān)測腫瘤免疫監(jiān)測移植免疫監(jiān)測HLA-B27檢測的臨床意義強(qiáng)直性脊柱炎陽性率90%以上

Reiter’s綜合癥70-90%

銀屑病性關(guān)節(jié)炎50-60%

葡萄膜炎40-50%

普通人群5-10%FCM在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用1）白血病和淋巴瘤的免疫分型，目前對白血病和淋巴瘤的診斷，國際上提出MIC分型，即通過形態(tài)（M）、免疫分型（I）、細(xì)胞遺傳學(xué)（C）檢測，對白血病和淋巴瘤進(jìn)行綜合診斷，免疫分型是重要的檢測項(xiàng)目之一。現(xiàn)在多應(yīng)用多參數(shù)的流式細(xì)胞術(shù)，不同抗體分別被幾種熒光素標(biāo)記：第一熒光（FL1）：FITC（異硫氰酸熒光素，F(xiàn)luorescein

isothiocyanate），F(xiàn)L2：PE（藻紅蛋白，Phycoerythrin）FL3：PerCP（多甲藻黃素葉綠素蛋白，peridininchlorophyllprotein），F(xiàn)L4：APC（別藻蘭蛋白allophycocyanin,）

能正確區(qū)別AML和ALL，并能進(jìn)一步區(qū)別

ALL中的T系和B系及亞型。能正確鑒別AML中的M0、M6、M7

診斷雙系或雙表型白血病發(fā)現(xiàn)僅表達(dá)個(gè)別次要非本系列相關(guān)抗原的白血病診斷少見疑難白血病(如毛細(xì)胞性白血病)免疫分型的價(jià)值白血病免疫分型診斷標(biāo)準(zhǔn) (EGIL)標(biāo)準(zhǔn)B淋巴系白血病Pro-B-ALL(BⅠ型)：CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+CommonALL(BⅡ型)：CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+，CD10+Pre-B-ALL(BⅢ型)：CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+，CyIgM+成熟-B-ALL(BⅣ型)：CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+，Kappa/Lambda+急性髓性白血病(AML)AML中，M0M6M7可以通過免疫分型確診診斷白血病主要標(biāo)志：B-ALL: CD34,HLA-DR,CD19,CD10+/-,cCD79aT-ALL: CD34,CD38,CD7,CD2+/-,CD5+/-,cCD3AML: CD34,CD117,CD33,CD13,cMPO

M3:CD34-,HLA-DR- M2:CD19+:t(8,21) M4/M5:CD14+ M6:GlyA+,CD71+ M7:IIb/IIIa(CD41,CD61)+2）CD34+造血干/祖細(xì)胞的檢測。主要用于干細(xì)胞移植及基因治療方面的檢測。3）活化血小板及網(wǎng)織血小板的檢測，在栓塞性疾病，如腦血管和心肌梗塞的患者，可出現(xiàn)活化的血小板增多。而血小板減少的患者，如果出現(xiàn)網(wǎng)織血小板增多，則說明血小板減少的原因?yàn)檠“迤茐倪^多所致。4）陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）的發(fā)病機(jī)制為X染色體上的PIG-A基因發(fā)生突變，引起糖化肌醇脂（GPI）錨合成障礙，使GPI錨連蛋白缺乏，已證實(shí)的GPI錨連蛋白有10余種，用于PNH診斷的主要為CD55和CD59兩種，如果在紅細(xì)胞或WBC上出現(xiàn)CD55或/和CD59的減少，可診斷為PNH。5）網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)6）白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)2.白血病的耐藥基因(MDR)檢測

MDR表達(dá)產(chǎn)物—P糖蛋白(P-gp)P-gp的作用機(jī)理

P-gp在白血病檢測中的臨床意義3.白血病的其它檢查(1)細(xì)胞凋亡的檢查

Fas及FasLApo2·7bcl-2P53

AnnexinⅤ

Caspase(半胱氨酸蛋白酶)(2)細(xì)胞DNA分析(3)白血病殘留病灶檢查(MRD)細(xì)胞分選

FCM可將樣本中所需要的細(xì)胞亞群從群體細(xì)胞中分離出來，即所謂分選(Sorting)。被測細(xì)胞的任何參數(shù)均可作為分選的依據(jù)。分選的方式一般有靜電分選和捕獲管分選，分選方式不同則決定分選的速度，分選純度一般可達(dá)99%以上。除細(xì)胞分選外還可進(jìn)行染色體分選。分選的細(xì)胞可用于克隆化培養(yǎng)、原位雜交、分子生物學(xué)研究等。從孕婦外周血中分離富集胎兒有核紅細(xì)胞用于產(chǎn)前診斷，染色體分選可用于基因診斷。三、操作方案PROTOCOL選定參數(shù)構(gòu)建直方圖區(qū)域，GATE，閾值，電壓和增益，補(bǔ)償條件。FCM的主要測定指標(biāo)FSC,SSC,FL1,FL2,FL3(FL4)其中：

FSC：反映細(xì)胞的大小

SSC：反映細(xì)胞內(nèi)顆粒性FCM標(biāo)記方法單標(biāo)：一種單抗/tube:FL1,FSC,SSC（三參數(shù)）雙標(biāo)：（兩種單抗/tube）：FL1,FL1,FSC,SSC（四參數(shù)）三/四標(biāo)：（三種單抗/tube）（四種單抗/tube）： FL1-FL3/4,FSC,SSC熒光素種類FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色530nmPE（藻紅蛋白）：橙黃色575nmPerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：深紅色 675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm 488nm波長的氬離子激光激發(fā)APC(別藻蘭蛋白）：紅色660nm630nm波長的氦氖激光或紅色二極管激光激發(fā)

PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原

FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原，適用范圍廣

biotin-avidin不適合弱抗原的檢測抗體的選擇數(shù)據(jù)顯示方式單參數(shù)直方圖雙參數(shù)二維點(diǎn)圖等高圖二維密度圖三維圖流式常見圖形(HistogramPlot)適用于：單參數(shù)分析流式常見圖形(DotPlot)適用于：多參數(shù)分析抗體的選擇首選直接標(biāo)記抗體熒光分子