第三章 細(xì)胞污染的檢測與排除

第三章

細(xì)胞培養(yǎng)的污染和排除細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞污染:

凡混入培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物，都應(yīng)視為污染。污染微生物的污染不同細(xì)胞類型的交叉污染細(xì)菌霉菌支原體化學(xué)物質(zhì)污染病毒污染途徑：

１．空氣:培養(yǎng)設(shè)施不宜置于通風(fēng)場所；定期清理凈化工作臺的過濾層，防止阻塞；操作中應(yīng)減少空氣流動；帶口罩；夏季潮濕季節(jié)空氣中含菌數(shù)量多，每立方米內(nèi)含菌數(shù)不應(yīng)超過1～5個。２．清洗消毒培養(yǎng)器皿和容器洗刷不凈殘留污物、培養(yǎng)用液滅菌不徹底等，都可引入有害物。３．操作實(shí)驗(yàn)操作馬虎、動作不準(zhǔn)確、消毒觀念不強(qiáng)，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口時不嚴(yán)，都可發(fā)生污染。同時培養(yǎng)兩種以上細(xì)胞，操作不慎，使用同一吸管或培養(yǎng)用液，可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。４．血清血清也是污染細(xì)胞的來源，有的市售血清制備水平低、檢測不嚴(yán)，常已被支原體和病毒污染。５．組織初代培養(yǎng)組織常有污染；有的是在手術(shù)中污染，有的本身可能是被污染的組織(如已經(jīng)發(fā)生潰爛的腫瘤組織)；手術(shù)用碘酒消毒后，擦拭不凈可能混入碘污染污染對細(xì)胞的影響

在細(xì)胞受有害物污染時間短、污染程度輕、并能及時排除污染物的情況下，細(xì)胞有可能恢復(fù)。當(dāng)污染物持續(xù)存在于培養(yǎng)環(huán)境中時，輕者細(xì)胞增殖生長緩慢、分裂相減少、細(xì)胞變得粗糙、細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，重者細(xì)胞停止增殖，分裂相消失，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓或崩潰從瓶壁脫落。1．細(xì)菌污染：細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴尽＜?xì)菌污染后大多能改變培養(yǎng)液pH使培養(yǎng)液變混濁，毒性大的細(xì)菌很快導(dǎo)致細(xì)胞崩解死亡。加用抗生素的培養(yǎng)用液一般可預(yù)防和排除個別少量細(xì)菌的污染。2．真菌污染：真菌種類繁多，形態(tài)各異，在霉雨季節(jié)更易污染。真菌污染后，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁，但污染后均不難發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下觀察呈絲狀、管狀或樹枝狀菌絲，縱橫交錯穿行于細(xì)胞之間。念珠菌和酵母菌呈卵圓形態(tài)，散在于細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。３．支原體污染支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見、不易被察覺和干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一種污染。支原體一般過濾除菌無法去除，開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見。細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，4.病毒污染采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。5.非同種細(xì)胞污染

由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，操作不當(dāng)，往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。如“靈長類”細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細(xì)胞的混合物，ERK/KD細(xì)胞是從兔腎中分離出來的，而現(xiàn)在卻認(rèn)為是HeLa細(xì)胞。真菌感染支原體污染

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細(xì)菌污染掃描電鏡法顯示支原體，附于細(xì)胞表面眾多的圓形顆粒為支原體污染的預(yù)防和排除重在預(yù)防，排除困難！1．抗生素排除法：一些有價值的細(xì)胞被污染后，可采用5～10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24～48小時，再換入常規(guī)培養(yǎng)液。有時可能奏效。2.加溫除菌

(用于清除支原體）根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。有人將受支原體污染的細(xì)胞置于41℃中作用5～10小時(最長可達(dá)18小時)以殺滅支原體。但41℃對培養(yǎng)細(xì)胞本身也有較大影響，故在處理前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定出最大限度殺傷支原體而對細(xì)胞影響較小的處理時間。3.動物體內(nèi)接種

受微生物污染的腫瘤細(xì)胞可接種在同種動物皮下或腹腔，借動物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅污染的微生物，腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)繼續(xù)生長，待一定時間后，從體內(nèi)取出再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。4.與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)

巨噬細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下仍然可吞噬微生物并將其消化。利用96孔培養(yǎng)板將極少量的培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細(xì)胞、極大地降