第五章 分子生物學(xué)基本研究法(上)

第五章分子生物學(xué)基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，得益于上個世紀(jì)中葉以來研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步?；虿僮髦饕―NA分子的切割與連接、雜交、電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達(dá)、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)?；蚬こ淌侵冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)?；蚬こ碳夹g(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件三大成就：在20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者、即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與表達(dá)機(jī)制。5.1基因操作的基本工具（一）限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點(diǎn)切開DNA分子。第一個核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個位點(diǎn)切開并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)BamHⅠGGATCCCCTAGGEcoRⅠGAATTCCTTAAGBanⅡHgiJⅡG(A/G)GC(TC)CC(T/C)CG(A/G)GEcoRⅤEco32ⅠGATATCCTATAGBglⅡAGATCTTCTAGAHindⅢAAGCTTTTCGAAAsuⅡBstBⅠTTCGAAAAGCTTPstⅠCTGCAGGACGTCBstPⅠEco91ⅠGGTNACCCCANTGGFbaⅠBclⅠTGATCAACTAGTDraⅠAhaⅢTTTAAAAAATTTMspⅠHpaⅡCCGGGGCCEco72ⅠCACGTGGTGCACKpnⅠGGTACCCCATGG圖5-1幾種主要DNA內(nèi)切酶所識別的序列及其酶切末端。PvuIIEcoRI（二）基因克隆的載體載體三要素：自我復(fù)制能力；攜帶外源基因片段大?。徊迦胛稽c(diǎn)多少；易于鑒定識別程度。僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上，才能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。具備自主復(fù)制能力的DNA分子就是分子克隆的載體（vector）。病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。pBR322質(zhì)粒載體由三個不同來源的部分組成的：第一部分來源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分則來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）。AmpR重組DNA操作過程示意圖圖5-2DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體

獲得了用外源DNA片段和載體分子重組而成的雜種DNA分子后，還必須通過一個被稱為細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過程將其重新導(dǎo)入到寄主細(xì)胞中，才能保證重組DNA分子的增殖（圖5-3）。圖5-3重組DNA操作過程示意圖

5.2DNA操作技術(shù)5.2.1核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段。一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。生理條件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離子（polyanions），在電場中向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個堿基對之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。表5-2瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力凝膠類型及濃度分離DNA的大小范圍（bp）

0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1圖5-4溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。圖5-4DNA脈沖電場凝膠電泳示意圖5.2.2細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法將體外構(gòu)建好的雜種DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。外源DNA通過自身載體上的復(fù)制起始點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制增殖，能在宿主細(xì)胞中長期保存下來，并能以完整的形式從細(xì)胞中被分離純化出來。細(xì)菌轉(zhuǎn)化（transformation），是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自供體菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。圖5-5細(xì)菌轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選

為提高效率，可對受體菌進(jìn)行物理或化學(xué)處理，增加其獲取DNA的能力。經(jīng)過這種處理的細(xì)胞被稱作感受態(tài)細(xì)胞（competentcells）。CaCl2法將快速生長期大腸桿菌置于經(jīng)0℃預(yù)處理的低滲CaCl2溶液中，細(xì)胞膨脹，膜通透性改變，易與外源DNA相粘附。將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激，外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞置于選擇性培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆。轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到5×106~2×107個轉(zhuǎn)化子/μg超螺旋質(zhì)粒DNA。DNA電擊法電脈沖可以在細(xì)胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。隨著跨膜電壓增加，大疏水性孔洞會轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性孔洞，介質(zhì)中的DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。將生長至對數(shù)中期的E.coli菌液冷卻至4℃后離心，洗菌后用10%的甘油懸浮，將高密度菌液（~2×1010/ml）置于特制的電極杯中進(jìn)行電擊。獲得最大轉(zhuǎn)化效率時場強(qiáng)一般為12.5~15kV/cm，時間跨度一般為4.5~5.5毫秒。電擊轉(zhuǎn)化與溫度有關(guān)，一般在0~4℃進(jìn)行。由于轉(zhuǎn)化載體上常帶有LacZ基因，多用帶有不同抗生素（常用的抗生素包括氨芐青霉素、卡那霉素和四環(huán)素等）的選擇性培養(yǎng)基結(jié)合α-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選法鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。5.2.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是快速擴(kuò)增DNA序列最常用的方法。PCR反應(yīng)的模板DNA若是基因組上的某個片段，就稱為genomicPCR，若是mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA，就稱為RT-PCR。PCR技術(shù)的原理首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點(diǎn)的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。

PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C5Primer15Primer255TemplateDNAPCR技術(shù)原理Cycle325～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。DNA解鏈（變性）引物與模板DNA相結(jié)合（退火）DNA合成（鏈的延伸）三步。經(jīng)不斷重復(fù)循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結(jié)合位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應(yīng)是2n,實得1.8n.圖5-7聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)圖5-8PCR指數(shù)擴(kuò)增時循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)物數(shù)量的比較1、將含有待擴(kuò)增DNA樣品的反應(yīng)混合物放置在高溫（>94℃）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA。94℃加熱，變性2、降低反應(yīng)溫度（退火，約50℃），約1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補(bǔ)序列位置上。50℃~60℃，退火引物與模板DNA相結(jié)合3、將反應(yīng)混合物的溫度上升到72℃左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互補(bǔ)鏈。PCR擴(kuò)增，72℃左右,按每分鐘1000個堿基對設(shè)計循環(huán)往復(fù)PCR反應(yīng)體系：

常用30μl，各種成分的實際用量應(yīng)根據(jù)實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的儲備液濃度進(jìn)行核算。10×buffer：1×30/10=3μlMgCl2:1.5×30/25=1.8μldNTPs:0.2×30/10=0.6μl引物P：0.4×30×2/10=2.4μlTaq酶(5U/μl)：1/5=0.2μl

模板：1μl

水：30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl

操作：

5份標(biāo)本總體積30μl×6=180μl1.取一0.5mlEp管，依次加入下列試劑：

10×buffer：3μl×6=18μlMgCl2:1.8μl×6=10.8μldNTPs:0.6μl×6=3.6μl

引物P：2.4μl×6=14.4μlTaq酶(5U/μl)：0.2μl×6=1.2μl

水：21μl×6=126μl

共174μl，先用移液器/指彈混勻，后用離心機(jī)瞬時混勻（管壁上液體沉至管底）。2.另取5支0.2mlEp管，分別加入上述液體29μl。3.分別取標(biāo)本模板各1μl，加入上述5支Ep管中，混勻，分別加入2滴液體石蠟（防止加溫過程中液體蒸發(fā)影響反應(yīng)體積），離心機(jī)瞬時離心，備用。4.反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增儀

94℃30″，55℃30″，72℃1′，

35個循環(huán)，72℃延伸5′。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：1、溫度、循環(huán)參數(shù)：⑴變性溫度和時間：保證模板DNA解鏈完全是保證整個PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90～95℃，30～60s，再復(fù)雜的DNA分子也可變性為單鏈。根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時間。一般情況下選擇94℃30″，可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。⑵復(fù)性溫度和時間：PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度的選擇，可根據(jù)引物的長度和G+C含量確定，長度在15～25bp之間時，復(fù)性溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)計算得到，一般位于40～60℃，30～60s。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。一般情況下選擇55℃30″，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。⑶延伸溫度和時間：一般位于Taq酶最適作用溫度70～75℃之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70～75℃。延伸反應(yīng)時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，<1Kb，1分鐘足夠；>1Kb需加長延伸時間，10Kb片段延伸時間可達(dá)15分鐘。延伸時間過長可出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，常用72℃1′。

⑷循環(huán)數(shù)：其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20～25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20～30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。2、MgCl2濃度：可顯著影響PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性

1.5～2.0mM

過高：增加非特異擴(kuò)增并影響產(chǎn)率過低：酶活性顯著下降。

3、引物：

0.2～1μM

偏高：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。偏低：產(chǎn)量降低。

引物設(shè)計原則：總原則是提高擴(kuò)增的效率和特異性引物設(shè)計原則⑴長度15～30b，過短特異性降低，過長則成本增加，產(chǎn)量也下降。⑵引物堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C含量宜在45～55%左右。⑶引物內(nèi)部不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)，兩個引物之間尤其在3’末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不然會形成引物二聚體。⑷引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性(<70%)或少于連續(xù)8個的互補(bǔ)堿基。要求在引物設(shè)計時采用計算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。⑸引物的5′

末端堿基：并沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠，其5′末端堿基可以不與模板DNA匹配呈游離狀態(tài)。最多可游離10個堿基并不影響PCR反應(yīng)進(jìn)行。⑹引物的3′

末端堿基：原則上要求引物的3′末端與模板DNA一定要配對，另外3′末端的末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。引物3′末端堿基在錯誤配對時不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異，最好選T、G、C，而不選A。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

1、凝膠電泳分析法：聚丙烯酰胺凝膠電泳靈敏度遠(yuǎn)高于瓊脂糖電泳，用于探討PCR擴(kuò)增的靈敏度效果好，但配制復(fù)雜，

常用瓊脂糖凝膠電泳。

2、點(diǎn)雜交

3、微孔板雜交法PCR技術(shù)的主要用途

1、目的基因的克隆：

PCR技術(shù)為在重組DNA過程中獲得目的基因片段提供了簡便快速的方法。

2、基因的體外突變：可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。

3、DNA和RNA的微量分析：

PCR技術(shù)高度敏感，對模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。實際工作中，一滴血液、一根毛發(fā)或一個細(xì)胞已足以滿足PCR的檢測需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應(yīng)用前景。4、DNA序列測定：

PCR技術(shù)的引入使DNA測序工作大大簡化，也提高了測序的速度。5、基因突變分析：利用PCR與一些技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。三、PCR技術(shù)的應(yīng)用（一）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。（二）錨定PCR（anchoredPCR）用于在體外擴(kuò)增未知序列的DNA片段的方法，而一般的PCR必須預(yù)先知道欲擴(kuò)增DNA片段兩側(cè)的序列，但人們經(jīng)常需要分析一端序列未知的基因片段，可利用錨定PCR。該法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人為賦予未知基因末端序列信息，再用人工合成的多聚尾互補(bǔ)的引物作為錨定引物，在與基因另一側(cè)配對的特異引物參與下，擴(kuò)增帶有同聚物尾的序列。（3）反向PCR（iversePCR）

常規(guī)PCR可擴(kuò)增位于二個引物之間的DNA片段，但不能擴(kuò)增引物外側(cè)的DNA序列，反向PCR則可擴(kuò)增引物外側(cè)的DNA片段，對已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究。（四）巢式PCR（nestedPCR）

是指利用兩套PCR引物（巢式引物）對進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個靶位點(diǎn)的可能性（因為與兩套引物都互補(bǔ)的引物很少）增加了檢測的敏感性；又有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。（五）原位PCR(InsituPCR)原位PCR是指在組織或細(xì)胞標(biāo)本片上直接進(jìn)行PCR，對細(xì)胞中的靶DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過摻入標(biāo)記基團(tuán)直接顯色或結(jié)合原位雜交進(jìn)行檢測的方法。可分為直接法和間接法。基本步驟：組織切片或細(xì)胞固定→蛋白酶消化→原位PCR擴(kuò)增→沖洗→產(chǎn)物檢測

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。（六）多重PCR（multiplexPCR）多重PCR是在同一反應(yīng)中采用多對引物同時擴(kuò)增幾個不同的DNA片段，如果基因某一區(qū)段缺失，則相應(yīng)的電泳圖譜上此區(qū)段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度減少或消失，從而發(fā)現(xiàn)基因異常。多重PCR具有靈敏快速特點(diǎn)，特別適用檢測單拷貝基因缺失、重排、插入等異常改變，其結(jié)果與Southernblotting一樣可靠，但多重PCR會檢測小片段缺失（七）不對稱PCR（asymmetricPCR）

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA

在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同引物濃度，一般用二種不同濃度的引物，50－100：1比例的引物濃度，在最初10－15個循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈DNA，但當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M后，高濃度引物介導(dǎo)的PCR反應(yīng)就會產(chǎn)生大量單鏈DNA。單鏈DNA可用作雜交探針或DNA測序。（八）免疫PCR(ImmunoPCR,Im-PCR)免疫PCR結(jié)合了抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR的高敏感性，是一種極為敏感的抗原檢測技術(shù)，適合于各種微量抗原的檢測。免疫PCR的關(guān)鍵在于形成抗體—標(biāo)記DNA耦聯(lián)物，作為橋梁連接免疫反應(yīng)的特異性和PCR的高擴(kuò)增能力。免疫PCR主要由兩個部分組成，第1部分是類似于普通ELISA的抗原抗體反應(yīng)，第2部分即常規(guī)的PCR擴(kuò)增和電泳檢測。

5.2.4實時定量PCR（realtimequantitativePCR，Q-PCR）由于PCR敏感性高，擴(kuò)增產(chǎn)物總量變異系數(shù)大，定量不準(zhǔn)確。90年代末期出現(xiàn)了Q-PCR，利用熒光檢測PCR儀繪制DNA擴(kuò)增過程中的累積速率動態(tài)變化圖，基本消除在測定終端產(chǎn)物豐度時變異系數(shù)較大的問題。混合在PCR反應(yīng)液中的熒光探針只有與大片段DNA結(jié)合后，才能夠被激發(fā)出熒光。隨著新合成DNA片段的增加，由于結(jié)合到DNA上的熒光探針增加，被激發(fā)產(chǎn)生的熒光相應(yīng)增加。非序列特異性熒光染料SYBRGreenI,激發(fā)光波長520nm。SYBRGreenI作探針的實時定量PCR實驗過程圖示HanP.,LiQ.,andZhuY.X.(2008)ThePlantCell20:1482-1493.

熒光強(qiáng)度為確保熒光檢測的確實是靶DNA，又設(shè)計了僅能與目的DNA特異結(jié)合的熒光探針。TaqMan探針是一段與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA，長50bp-150bp，該DNA的5’和3’端帶有短波長和長波長兩個不同熒光基團(tuán)，由于彼此距離靠近，在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）作用下發(fā)生熒光淬滅，因而檢測不到熒光。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，TaqMan探針結(jié)合到目的DNA序列上，并且會被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐個切除而降解。切下來的熒光基團(tuán)解除了熒光淬滅的束縛，會在激發(fā)光下發(fā)出熒光，因此，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度直接反映了所擴(kuò)增靶DNA的總量。TaqMan探針實時定量PCR技術(shù)Ct值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度首次超過設(shè)定閾值時，PCR反應(yīng)所需的循環(huán)數(shù)。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以確定樣品中待檢測靶DNA的絕對含量。圖5-11用實時定量PCR法分析未知樣品靶基因的絕對表達(dá)量。5.2.5基因組DNA文庫構(gòu)建把某種生物的基因組DNA切成適當(dāng)大小，分別與載體組合，導(dǎo)入微生物細(xì)胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克?。ɡ碚撋厦總€序列至少有一個代表），這樣的克隆片段的總匯，稱為基因組DNA文庫。圖5-13用Sau3A限制性核酸內(nèi)切酶消化真核生物基因組DNA并利用噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的過程圖示。DNA文庫的完備性Clark和Carbon于1975年提出公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)式中：N表示一個基因組文庫所應(yīng)該包含的重組克隆數(shù)目；p表示所期望的靶基因在文庫中出現(xiàn)的概率；f表示重組克隆平均插入片段的長度與基因組DNA總長的比值。為獲得整個基因簇或一個基因及其兩翼延伸序列，基因組文庫中的DNA片段常大于20kb。以人為例，其基因組大小為3×109bp若p=99%，平均插入片段大小為20kb，則N=6.7×105。構(gòu)建基因組文庫最常用的是λ噬菌體載體（克隆能力約15—20kb）和限制性內(nèi)切酶部分消化法。例如用識別4個核苷酸的核酸限制性內(nèi)切酶Sau3A，與BamHI是一對同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切產(chǎn)生的DNA片段可插入到經(jīng)BamHI消化的λ噬菌體載體上。λ噬菌體作為克隆載體此外，還有很多大容量克隆載體，如柯斯質(zhì)粒、細(xì)菌人工染色體（BAC）、P1源人工染色體（PAC）、酵母人工染色體（YAC）等都可用于基因組文庫的構(gòu)建。它們的優(yōu)點(diǎn)是可以插入更大片段DNA，但是穩(wěn)定性一般較差，在大量復(fù)制的過程中容易出現(xiàn)缺失現(xiàn)象。操作也相對較困難。5.3RNA基本操作技術(shù)真核生物基因組DNA龐大，有大量重復(fù)序列，很難直接分離得到靶基因片段。而cDNA來自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，無冗余序列，通過篩選cDNA文庫，可較快地分離到相關(guān)基因。細(xì)胞中的總RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一個典型的動物細(xì)胞約含10-5μgRNA，其中：80%-85%為rRNA15%-20%為tRNA及sRNAmRNA約占總RNA的1%-5%rRNA分子具有確定的大小和核苷酸序列，特別是28S和18S特征性條帶是電泳鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)。LiQetal.(2006)J.Integr.PlantBiol.48:114-120.RNA提取的基本原理與方法（一）總RNA提取的基本原理與方法1、原理通過變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA，再經(jīng)過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。提取步驟：破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA。所有RNA的提取過程中都有五個關(guān)鍵點(diǎn)，即：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑:1、提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；2、直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相。2、總RNA提取的方法（1）（異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機(jī)層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。（二）mRNA的提取mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA3’末端含有Poly（A+）的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。圖5-14PolyATtractmRNA的分離純化過程簡圖。三、DNA或RNA濃度、純度和相對分子質(zhì)量的測定（一）分光廣度法DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，其吸收峰在260nm處。波長為260nm時，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。對標(biāo)準(zhǔn)樣品來說，濃度為1μg/ml時，DNA鈉鹽的OD260＝0.02當(dāng)OD260＝1時，dsDNA濃度約為50μg/mlssDNA濃度約為37μg/mlRNA濃度約為40μg/ml

核苷酸濃度約為30μg/ml（由于底物不同有差異）DNA樣品的濃度（μg/μl）:OD260×稀釋倍數(shù)×50/1000RNA樣品的濃度（μg/μl）:OD260×稀釋倍數(shù)×40/1000當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時，會影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測定。一般情況下同時檢測同一樣品的OD260、OD280和OD230，計算其比值來衡量樣品的純度。經(jīng)驗值：純DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染）純RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7時表明有蛋白質(zhì)或酚污染；＞2.0時表明可能有異硫氰酸殘存）若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時無法用分光光度法對核酸進(jìn)行定量，可使用方案二的方法或其他方法進(jìn)行估算。由于RNA分子敏感脆弱，在自然狀態(tài)下難以被擴(kuò)增，為了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般將其反轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定的DNA雙螺旋（cDNA，complementaryDNA），再插入到可以自我復(fù)制的載體中。圖5-15cDNA合成過程示意圖。圖5-16定向cDNA合成及分子修飾因為絕大多數(shù)大腸桿菌細(xì)胞都會切除帶有5'-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以實驗中常選用mcrA-mcrB-菌株以防止cDNA被降解。cDNA文庫的構(gòu)建cDNA的長度一般在0.5-8kb之間，質(zhì)粒載體和噬菌體類載體都能滿足要求。cDNA文庫常用Uni-zapXR（一種λ噬菌粒載體）做載體，它具備噬菌體的高效性和質(zhì)粒載體系統(tǒng)利用藍(lán)白斑篩選的便利，可容納0-10kbDNA插入片段，含有pBluescript載體的全部序列。重組后可通過體內(nèi)剪切反應(yīng)（InVivoExcision）將cDNA插入片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒系統(tǒng)中進(jìn)行篩選、克隆和序列分析?；蛭膸斓暮Y選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選的方法有很多種，如核酸雜交法，PCR篩選法和免疫篩選法等。1、核酸雜交法：核酸雜交法以其廣泛的適用性和快速性成為基因文庫篩選中最常用的一種方法，用放射性標(biāo)記的特異DNA探針適用于高密度的菌落雜交篩選。將待篩選菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，適當(dāng)溫育。同時保留原來的菌落平板作對照。取出已經(jīng)長有菌落的膜，用堿液處理，使菌落發(fā)生裂解，DNA隨之變性。用蛋白酶K處理硝酸纖維素膜去除蛋白質(zhì)，形成菌落DNA的印跡。80℃烘烤濾膜，將DNA固定在膜上。將濾膜與放射性標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交，通過放射性自顯影顯示雜交結(jié)果。通過對應(yīng)于平板上的位置找到相應(yīng)克隆。圖5-17通過核酸雜交篩選目的克隆流程圖2、PCR篩選法將整個文庫（以質(zhì)粒的形式或者細(xì)菌的形式均可）保存在多孔培養(yǎng)板上，用設(shè)計好的目的基因探針對每個孔進(jìn)行PCR篩選，鑒定出陽性的孔，把每個陽性孔中的克隆再稀釋到次級多孔板中進(jìn)行PCR篩選。重復(fù)以上程序，直到鑒定出與目的基因?qū)?yīng)的單個克隆為止。3、免疫篩選法該法僅適用于對表達(dá)文庫的篩選。若實驗中靶基因的序列完全未知但是有針對該基因產(chǎn)物的特異性抗體，就可以采用免疫篩選法。圖5-18噬菌體表達(dá)文庫的免疫化學(xué)篩選法示意圖

5.4SNP的理論與應(yīng)用SNP是SingleNucleotidePolymorphism的縮寫，即單核苷酸多態(tài)性，指基因組DNA序列中由于單個核苷酸（A，T，C和G）的突變而引起的多態(tài)性。5.4.1SNP（單核苷酸多態(tài)性）概述科學(xué)上把染色體DNA同一位置上的每個堿基類型叫做一個等位位點(diǎn)。SNP是基因組中最簡單最常見的多態(tài)性形式，具有很高的遺傳穩(wěn)定性。SNP檢測和分析技術(shù)已經(jīng)成為繼限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）和微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）之后的第三代遺傳標(biāo)記。圖5-19染色體上共同遺傳的SNP組合。圖中SNP1和SNP2在同一條染色體上而且距離很近，SNP1有等位位點(diǎn)A和G，SNP2有等位位點(diǎn)G和T。因此，染色體對有兩種可能的SNP組合。單倍型基因型外顯子IV內(nèi)含子IV57130165232236H1H-4TTATTH-3TTATTH-1TTATTE-2TTATTB-73TTATTH2MO17CTACCB-1CTACCH3H60CCTTT玉米globulin1不同單倍型和基因型之間的多態(tài)性比較

據(jù)估計，人類DNA中每300-1000個堿基對就有一個SNP，因此，一個人類個體大約攜帶300萬-1000萬個SNPs。位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)被稱作單倍型（haplotype），相鄰SNPs的等位位點(diǎn)傾向于以一個整體遺傳給后代。因此,SNP成為第三代遺傳標(biāo)志,人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關(guān)。

現(xiàn)在普遍認(rèn)為SNP研究是人類基因組計劃走向應(yīng)用的重要步驟。這主要是因為SNP將提供一個強(qiáng)有力的工具，用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計和測試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究等。SNP在基因組中分布相當(dāng)廣泛。大量存在的SNP位點(diǎn)，使人們有機(jī)會發(fā)現(xiàn)與各種疾病，包括腫瘤相關(guān)的基因組突變；從實驗操作來看，通過SNP發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因突變要比通過家系來得容易；有些SNP并不直接導(dǎo)致疾病基因的表達(dá)，但由于它與某些疾病基因相鄰，而成為重要的標(biāo)記。SNP在基礎(chǔ)研究中也發(fā)揮了巨大的作用，近年來對Y染色體SNP的分析，使得在人類進(jìn)化、人類種群的演化和遷徙領(lǐng)域取得了一系列重要成果。根據(jù)SNP在基因組中的分布位置分為編碼區(qū)SNP（cSNP），調(diào)控區(qū)SNP（pSNP）和非編碼區(qū)SNP（rSNP）三類。編碼區(qū)內(nèi)的變異率僅占周圍序列的1/5，cSNP的總量顯著少于其它兩類SNPs。cSNP分為同義cSNP（synonymouscSNP），編碼序列的改變不影響所翻譯的氨基酸序列）和非同義cSNP（non-synonymouscSNP），堿基序列的改變使氨基酸序列發(fā)生改變，可能影響蛋白質(zhì)的功能。5.4.2SNP的檢測技術(shù)通過DNA測序法獲得新的SNP。基因分型（genotyping）是指利用數(shù)據(jù)庫中已有的SNP進(jìn)行特定人群的序列和發(fā)生頻率的研究，主要包括基因芯片技術(shù)、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)（molecularbeacons）技術(shù)和焦磷酸測序法（pyrosequencing）等。1．基因芯片技術(shù)通過優(yōu)化芯片雜交程序，使探針只與完全互補(bǔ)的序列雜交而不與含有單個錯配堿基的序列雜交。優(yōu)點(diǎn)是高通量，一次可對多個SNP進(jìn)行規(guī)模性篩選，被檢起始材料也很少，操作步驟簡單。缺點(diǎn)是芯片設(shè)計成本高。而且，由于DNA樣品的復(fù)雜性，有些SNP不能被檢測。2．Taqman技術(shù)PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入2種不同熒光標(biāo)記的分別與兩個等位基因配對的探針。隨著PCR的進(jìn)行，與模板完全配對的探針逐步被TaqDNA聚合酶的5’→3’外切活性所切割，熒光基團(tuán)與3’端的淬滅基團(tuán)分離，熒光基團(tuán)被激活。不完全配對的探針（代表另一種等位基因）不能被有效切割，供體熒光基團(tuán)依然被淬滅。3．分子信標(biāo)（molecularbeacon）技術(shù)是一種呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)的熒光標(biāo)記的寡核苷酸，環(huán)狀區(qū)與靶序列特異性結(jié)合，莖干區(qū)由5-8個堿基對組成，5’端帶有熒光發(fā)生基團(tuán)，3’端帶有熒光淬滅基團(tuán)。自由狀態(tài)時，分子信標(biāo)呈發(fā)卡式結(jié)構(gòu)，熒光幾乎完全淬滅。與靶分子相結(jié)合時，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間的距離增大，分子信標(biāo)的熒光恢復(fù)。Taqman技術(shù)（上）及分子信標(biāo)技術(shù)（下）原理示意圖。5.5基因克?。╟lone）技術(shù)在多細(xì)胞的高等生物個體水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotictwins）便是屬于同一克隆。在細(xì)胞水平上，克隆一詞是指由同一個祖細(xì)胞（progenitorcell）分裂而來的一群帶有完全相同遺傳物質(zhì)的子細(xì)胞。在分子生物學(xué)上，人們把將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復(fù)制這種過程稱為克隆。RACE技術(shù)（rapidamplificationofcDNAends）在已知cDNA序列基礎(chǔ)上克隆5’或3’端缺失序列的技術(shù)。根據(jù)已知序列設(shè)計基因片段內(nèi)部特異引物，由該片段向外側(cè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的序列。用于擴(kuò)增5’端的方法稱為5’RACE，用于擴(kuò)增3’端的稱為3’RACE。5’RACE在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以基因片段內(nèi)部特異性引物（GSP1）啟始cDNA第一條鏈合成。RNase降解模板鏈mRNA，純化第一鏈。用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA鏈3’端加入連續(xù)的dCTP。以連有oligo(dG)

的錨定引物和基因片段內(nèi)部特異的nested引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段，用nestPCR檢測。3’RACE1、用oligo(dT)錨定引物啟始cDNA第一鏈的合成.2、降解模板mRNA.3、用通用錨定引物和基因片段內(nèi)部特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的3’片段，用nestPCR法檢測.5.5.2cDNA差示分析法

(RDA,RepresentationDifferenceAnalysis)通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴(kuò)增目的基因片段。因為Tester和Driver在接受差示分析前均經(jīng)一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。每次T減D反應(yīng)后僅設(shè)置72℃復(fù)性與延伸，94℃變性這兩個參數(shù)共20個PCR循環(huán)，PCR產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度高。5.5.3Gateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)Gateway技術(shù)利用λ噬菌體進(jìn)行位點(diǎn)特異性DNA片段重組，實現(xiàn)了不需要傳統(tǒng)的酶切聯(lián)接過程的基因快速克隆和載體間平行轉(zhuǎn)移。Gateway大規(guī)模克隆策略TOPO反應(yīng):將目的基因PCR產(chǎn)物連入Entry載體。載體上的CCCTT被拓?fù)洚悩?gòu)酶所識別，通過與切口處的磷酸基團(tuán)形成共價鍵，將該酶偶聯(lián)在載體上。5’GTGG粘性末端攻擊PCR產(chǎn)物的互補(bǔ)性末端并與接頭序列CACC退火，使PCR產(chǎn)物以正確方向連入Entry載體。LR反應(yīng)：將目的片段從Entry載體中重組入表達(dá)載體。Entry載體上基因兩端具有attL1和attL2位點(diǎn)，目的載體上含有attR1和attR2位點(diǎn)，在重組蛋白的作用下發(fā)生定向重組，形成新的位點(diǎn)attB1和attB2，將目的基因轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體中。GetEntryVectorGetExpressionVectorGetcDNATOPOLR120AP2/EREBPgeneswereclonedFengJXetal(2005)AsystematicannotationupdateviacDNAsequenceanalysisandcomprehensiveprofilingofdevelopmental,hormonalorenvironmentalresponsivenessoftheArabidopsisAP2/EREBPtranscriptionfactorgenefamily.PMB59:853-8基因的圖位克隆法（Map-basedcloning）所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過該方法克隆得到。通過構(gòu)建遺傳連鎖圖，將目的基因定位到某個染色體的特定位點(diǎn)，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記。通過對不同的生態(tài)型及限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的分子標(biāo)記，通過染色體步移法將位于這兩個標(biāo)記之間的基因片段克隆并分離出來，根據(jù)基因功能互作原理鑒定目的基因。圖5-26染色體步移法克隆基因示意圖在RFLP作圖中，連鎖距離是根據(jù)重組率來計算的，1cM（厘摩）相當(dāng)于1%的重組率。人類基因組中，1cM≈1000kb；擬南芥菜中，1cM≈290kb；小麥中，1cM≈3500kb。用圖位克隆法獲得水稻脆桿基因BCl

將BCl定位于水稻3號染色體（Chr3）分子標(biāo)記C524a和RM16之間；B.覆蓋BCl位點(diǎn)的BAC大片段。C.BCl位點(diǎn)的精細(xì)定位。BCl位點(diǎn)被定位于分子標(biāo)記P2和P4之間與P3共分離。D