選修一23分解纖維素的微生物的分離

課題3分解纖維素的微生物的分離現(xiàn)在，我們都清醒地認(rèn)識到，能源危機正在影響著我們每一個人的生活。國際油價不斷攀升，導(dǎo)致物價隨之上漲。為什么石油價格會持續(xù)上漲呢？現(xiàn)在，世界上的許多科學(xué)家正致力于生物燃料方面的研究。目前，第一代生物燃料以食用作物為原料，主要包括玉米、大豆、甘蔗，用可食用作物制造生物燃料是最簡單可行的，因為把這些可食用作物轉(zhuǎn)化為燃料的技術(shù)是現(xiàn)成的。然而，第一代生物燃料并非長久之計，原因很簡單：沒有足夠的耕地能夠滿足制造生物燃料的原料需求。

第二代生物燃料主要以纖維素為原料。富含纖維素的原料有很多：木材廢料（鋸木屑、木質(zhì)建筑殘片）、農(nóng)業(yè)廢棄物（各種植物秸稈）、雜草等。這些作物耕作成本低、量大，更關(guān)鍵的是，這些作物的種植生產(chǎn)不會干擾和危及糧食生產(chǎn)。這些作物大多數(shù)能夠在不能用作農(nóng)田的邊際土地上快速生長。還有一些能夠在被廢水或者重金屬污染的土壤中生長并凈化土壤，如生長周期較短的灌木柳樹。一.基礎(chǔ)知識㈠.纖維素與纖維素酶1.纖維素

纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。思考：纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過70億噸，但卻不會在地球上大量的積累，為什么？

纖維素能被土壤中某些微生物分解利用，這是因為它們能夠產(chǎn)生纖維素酶。2.纖維素酶

纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纖維素①取二支20mL的試管實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗②各加入一張濾紙條③各加入pH4.8、物質(zhì)的量濃度為0.1mol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液11ml和10ml甲乙④在乙試管中加入1mL纖維素酶⑤兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min的搖床上振蕩1h⑥結(jié)果：乙試管的濾紙條消失本實驗的自變量是纖維素酶的有無，自變量的操縱方法是：在一支試管中添加適量（1mL）的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素酶，但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，否則會影響溶液的pH。實驗分析：本實驗的實驗變量是什么？是如何設(shè)置對照的？㈡.纖維素分解細菌的篩選：1.方法：剛果紅染色法。

剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，我們可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。2.原理：該方法可以通過顏色反應(yīng)直接篩選。3.優(yōu)點：二.實驗設(shè)計與操作㈠.實驗設(shè)計：土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落①分布環(huán)境1、土壤取樣：富含纖維素的環(huán)境中由于生物適應(yīng)一定的環(huán)境，環(huán)境對生物有選擇作用，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對較高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。②為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？(旁欄思考)③實例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。④討論:如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋在土壤中多深？答：將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。2、選擇培養(yǎng)

增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。

①目的：分析書本P29纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方，回答問題。答：用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照，或者將纖維素改為葡萄糖，菌落明顯增多?；蚪臃N不分解纖維素的細菌。②思考：A、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？答：是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）B、這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進行選擇的？答：具有選擇作用，本配方中以纖維素作為唯一碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。C、你能否設(shè)計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用。

稱取土樣20g，在無菌條件下加入裝有30mL培養(yǎng)基的搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30℃下振蕩培養(yǎng)1～2d，至培養(yǎng)基變混濁。吸取一定的培養(yǎng)液（約5mL），轉(zhuǎn)移至另一瓶新鮮的選擇培養(yǎng)基中，以同樣的方法培養(yǎng)到培養(yǎng)液變渾濁。③操作：提示：在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用?！寂詸谒伎碱}〗為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進行等比稀釋101～107倍。3.梯度稀釋4.將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上⑴制備鑒別培養(yǎng)基:配方見書本29頁。操作過程見課題1（2）涂布平板：將稀釋度為104～106的細菌

懸液各取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，在30℃的條件下倒置培養(yǎng)。5.剛果紅染色法方法一：先

，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)。方法二：在

時就加入剛果紅。培養(yǎng)微生物倒平板方法一中NaCl溶液的作用？過程見書〖旁欄思考題〗這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足？顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用操作繁瑣剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜操作簡便，不存在菌落混雜問題1.產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素（剛果紅），形成明顯的透明圈。挑選產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C－370C培養(yǎng)，可獲得純凈培養(yǎng)物。6、純化培養(yǎng)四、課題延伸

為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗，纖維素的發(fā)酵方法有________和_________。纖維素酶的測定方法一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的_______進行定量的測定。葡萄糖液體發(fā)酵固體發(fā)酵提示：課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為惟一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題先通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在鑒別培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致?！寂詸谒伎碱}〗本實驗的流程與課題2中的實驗流程有哪些異同？課題成果評價

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落：對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物（二）分離的結(jié)果是否一致：

由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，學(xué)生也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。練習(xí)1、在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌，符合下列哪一生物學(xué)觀點？（）A、生物結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)的觀點B、生物結(jié)構(gòu)與功能整體性觀點C、生物與環(huán)境相適應(yīng)的觀點D、生物發(fā)展進化的觀點2、從土壤中分離獲得某種微生物的步驟是（）①土壤取樣②梯度稀釋③選擇培養(yǎng)④菌懸液涂布平板⑤挑選出單個菌落A、①②③④⑤B、①③②④⑤C、①②④③⑤D、①④②③⑤3、有關(guān)選擇培養(yǎng)正確的敘述是（）A、可以增加纖維素分解菌的濃度B、可以減少纖維素分解菌的濃度C、所用培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基D、所用培養(yǎng)基是平板培養(yǎng)基CBA4.培養(yǎng)流感病毒時，應(yīng)選用()A．固體培養(yǎng)基

B．含有多種無機鹽的培養(yǎng)液C．活的雞胚

D．無菌的牛肉湯5．微生物（除病毒外）需要從外界吸收營養(yǎng)物質(zhì)并通過代謝來維持正常的生長和繁殖。下列有關(guān)微生物營養(yǎng)的說法正確的是()A．乳酸菌與硝化細菌所利用的碳源物質(zhì)是相同的

B．微生物生長中不可缺少的一些微量的無機物稱為生長因子

C．培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)濃度越高對微生物的增殖越有利D．生長因子一般是酶或核酸的組成成分，微生物本身合成這些生長因子的能力往往不足CD6．在接種操作的過程中，不正確的是()A．要將接種環(huán)灼燒滅菌

B．取下棉塞后要將試管口灼燒滅菌C．將接種環(huán)伸入試管內(nèi)，先接觸長菌多的部位

D．接種后還要將管口滅菌加塞7．高壓蒸氣滅菌的原理是()A．高壓使細菌DNA變性

B．高壓使細菌蛋白質(zhì)凝固變性C．高溫燙死細菌

D．高溫使細菌DNA變性CB8．下列屬于菌落特征的是…………()①菌落的形狀②菌落的大?、劬涞亩嗌佗苈∑鸪潭娶蓊伾抻袩o莢膜

A．①②③④B．①②④⑤

C．②③④⑥D(zhuǎn)．①②③④⑤⑥9．能排除培養(yǎng)基是否有雜菌污染的方法是……()A．將未接種的培養(yǎng)基放在實驗桌上培養(yǎng)B．將未接種的培養(yǎng)基放在窗臺上培養(yǎng)C．將未接種的培養(yǎng)基放在恒溫箱中培養(yǎng)D．將已接種的培養(yǎng)基放在恒溫箱中培養(yǎng)BC10、(20分)某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：(1)培養(yǎng)基中加入化合物A的目的是篩選

，這種培養(yǎng)基屬于

培養(yǎng)基。目的菌

選擇性

某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：（北京卷）(2)“目的菌”生長所需的氮源和碳源是來自培養(yǎng)基中的

，實驗需要振蕩培養(yǎng)，由此推測“目的菌”的代謝類型是

?；衔顰異養(yǎng)需氧某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：(3)培養(yǎng)若干天后，應(yīng)選擇培養(yǎng)瓶中化合物A含量

的培養(yǎng)液，接入新的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)，使“目的菌”的數(shù)量

。

減少

增加

某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：(4)轉(zhuǎn)為固體培養(yǎng)時，常采用

方法接種，獲得單菌落后繼續(xù)篩選。

劃線某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：(5)實驗結(jié)束后，使用過的培養(yǎng)基應(yīng)該進行

處理后，才能倒掉。

滅菌根據(jù)用途分選擇培養(yǎng)基——在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長,促進所需要的微生物的生長鑒別培養(yǎng)基——在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,用以鑒別不同種類的微生物。例如：伊紅和美藍,和大腸桿菌的代謝產(chǎn)物結(jié)合,使菌落呈黑色（老教材說法：深紫色,帶有金屬光澤）,鑒別大腸桿菌方法一中NaCl溶液的作用？

漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細菌可以產(chǎn)生纖維素