第五章 核酸化學(xué)

第四章核酸化學(xué)核酸是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲存與傳遞。核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。核酸概述核酸發(fā)現(xiàn)簡史1868年，瑞士外科醫(yī)生F.Miescher從細(xì)胞核中分離得到一種酸性物質(zhì)，即現(xiàn)在被稱為核酸的物質(zhì)，實(shí)質(zhì)是一種核糖核蛋白19世紀(jì)末－20世紀(jì)初,德國生理學(xué)家Kossel等對核酸化學(xué)組成進(jìn)行了初步研究，其學(xué)生Levene繼續(xù)研究了核酸的結(jié)構(gòu)1944O.AveryDNA是遺傳物質(zhì)1928年，英國細(xì)菌學(xué)家，醫(yī)生FredGriffith的體內(nèi)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)Protease+1944年，Avery的轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)噬菌體感染實(shí)驗(yàn)1953年，Watson，Crick提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，使生物化學(xué)進(jìn)入了分子水平時(shí)代。1958年，Meselson和Stahl用同位素標(biāo)記證明DNA的復(fù)制方式是半保留復(fù)制。50年代以后，飛速發(fā)展，不僅分離出各種核酸，而且發(fā)展產(chǎn)生了遺傳工程（基因工程）等生物技術(shù)。

目前，基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)、調(diào)節(jié)已成為現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究中心。1980年，生物學(xué)家、諾貝爾獎(jiǎng)得主H.Dulbecco提出人類基因組計(jì)劃，HGP（HumanGenomicProject）。1990年，美國決定用30億美元、15年時(shí)間完成HGP，中國于1999年加入并承擔(dān)1%測序任務(wù)，現(xiàn)已基本完成。后基因組時(shí)代：

功能基因組學(xué)：蛋白質(zhì)組學(xué)，細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)：RNA組學(xué)，研究細(xì)胞全部功能RNA結(jié)構(gòu)、作用。核酸與蛋白質(zhì)一樣，是一切生物有機(jī)體不可缺少的組成部分。核酸是生命遺傳信息的攜帶者和傳遞者，它不僅對于生命的延續(xù)，生物物種遺傳特性的保持，生長發(fā)育，細(xì)胞分化等起著重要的作用，而且與生物變異，如腫瘤、遺傳病、代謝病等也密切相關(guān)。因此，核酸的研究是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的重要基礎(chǔ)之一。4.1.2核酸的種類和分布

核酸分為兩大類：脫氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid（DNA）核糖核酸RibonucleicAcid（RNA）DNA（脫氧核糖核酸）RNA（核糖核酸）mRNA（信使RNA）tRNA（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA）rRNA（核糖體RNA）核酸98％核中（染色體中）真核線粒體（mDNA）核外葉綠體（ctDNA）DNA擬核原核核外：質(zhì)粒（plasmid）病毒：DNA病毒

RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中tRNA:轉(zhuǎn)移RNArRNA:核糖體RNAmRNA：信使RNA其它RNARNA病毒：SARS特殊功能的RNA非編碼RNA(ncRNA)小RNA(sRNA)SmallnuclearRNA,snRNA（核）SmallnucleoarRNA,snoRNA（核仁）SmallcytoplasmicRNA,scRNA（胞質(zhì)）microRNA、siRNA、piRNAAntisenseRNARibozymeRNasePRNA功能的多樣性1、參與蛋白質(zhì)的合成2、RNA的轉(zhuǎn)錄后加工與修飾3、參與基因表達(dá)的調(diào)控4、生物催化作用5、遺傳信息的載體6、引物第一節(jié)核酸的基本化學(xué)組成核酸完全水解產(chǎn)生嘌呤和嘧啶等堿性物質(zhì)、戊糖（核糖或脫氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解則產(chǎn)生核苷和核苷酸。每個(gè)核苷分子含一分子堿基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除產(chǎn)生核苷外，還有一分子磷酸。核酸的各種水解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離鑒定。核酸nucleicacid核苷酸nucleotide核苷nucleoside磷酸phosphate嘌呤堿purinebase或嘧啶堿pyrimidinebase（堿基base）核糖ribose

或脫氧核糖deoxyribose

（戊糖amylsugar）組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為β-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為β-D-核糖。一、戊糖RiboseDeoxyriboseβ-D-（+）呋喃核糖β-D-（+）呋喃脫氧核糖1.嘧啶（Pyrimidine）123456尿嘧啶uracilU胞嘧啶cytosineC胸腺嘧啶thymineT二、堿基RNA:C,UDNA:C,T2.嘌呤（Purine）123456978腺嘌呤AdenineA鳥嘌呤guanineG接近平面，具有固定鍵長、鍵角；酮式和烯醇式互變，氨基態(tài)和亞氨基態(tài)互變。核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。7-甲基鳥苷酸5-甲基胞苷N6-甲基腺苷N2-甲基鳥苷5-羥甲基胞苷次黃嘌呤核苷假尿嘧啶核苷4-硫代尿苷7-甲基鳥苷酸三、核苷（nucleoside）核苷戊糖+堿基

糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)★嘧啶堿：C1—N1，嘌呤堿：C1—N9?！锖怂嶂械暮塑张c脫氧核苷均為β-型★堿基平面與核糖平面互相垂直★戊糖的標(biāo)號為’RNA：中的核苷稱核糖核苷（或稱核苷）：腺苷（A）、鳥苷（G）、胞苷（C）、尿苷（U）。DNA：中的核苷稱脫氧核糖核苷（或稱脫氧核苷）：脫氧腺苷（dA）、脫氧鳥苷（dG）、脫氧胞苷（dC）和脫氧胸苷（dT），“d”表示脫氧。AdenosineGuanosineCytidineUridineRNA:尿嘧啶核苷DNA:脫氧胸腺嘧啶核苷DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMPRNA：AMP、GMP、CMP、UMP1、

構(gòu)成DNA、RNA的核苷酸DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMPRNA：AMP、GMP、CMP、UMP四、核苷酸（nucleotide）

核苷酸核苷+磷酸

戊糖+堿基+磷酸HHHHHHHHH磷酸所連接位置：3’，5’

磷酯鍵

核苷中戊糖C2、C3、C5羥基被磷酸酯化多聚核苷酸（核酸）多聚核苷酸是通過一個(gè)核苷酸的C3’-OH與另一分子核苷酸的5’-磷酸基形成3’,5’-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。5’5’3’3’核酸的連接方式單核苷酸之間的連接鍵：3,5-磷酸二酯鍵核酸鏈的二個(gè)游離末端:5磷酸基末端3羥基末端書寫方向：5

35磷酸基末端3羥基末端3,5-磷酸二酯鍵

5'3'OHOPHHOHHHOOOHOPOOHHOHHHOHOPOOHHOHHHOHOPOOHHOHHHO鳥嘌呤胞嘧啶腺嘌呤胸腺嘧啶腺嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶鳥嘌呤PPPP5'3'PAPCPTPGA.B.C.DNA多核苷酸鏈的結(jié)構(gòu)及其縮寫式表示法PA

CTG---H2CH2CH2CH2C5’3’沒有分枝，線性結(jié)構(gòu)（原核可成環(huán)）方向性：鏈兩端的核苷酸殘基不同書寫時(shí)，5’端在左側(cè)，3’端在右側(cè)

2、細(xì)胞內(nèi)的游離核苷酸及其衍生物①核苷5’-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代謝和物質(zhì)代謝及調(diào)控中起重要作用。②環(huán)核苷酸3’,5’-cAMP，3’,5’-cGMP信號分子，cAMP調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖代謝、脂代謝。③核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物ppGpppppGppppApp④核苷酸衍生物HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等輔助因子。GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供體。核苷酸的衍生物ATP是生物體內(nèi)分布最廣和最重要的一種核苷酸衍生物ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸)ATP腺苷三磷酸三磷酸腺苷三磷腺苷腺三磷AMPADPATPATP的性質(zhì)ATP分子的最顯著特點(diǎn)是含有兩個(gè)高能磷酸鍵。ATP水解時(shí),可以釋放出大量自由能。ATP是生物體內(nèi)最重要的能量轉(zhuǎn)換中間體。ATP水解釋放出來的能量用于推動生物體內(nèi)各種需能的生化反應(yīng)。ATP也是一種很好的磷?；瘎?。磷?；磻?yīng)的底物可以是普通的有機(jī)分子，也可以是酶。磷?；牡孜锓肿泳哂休^高的能量（活化分子），是許多生物化學(xué)反應(yīng)的激活步驟。

(2)GTP(鳥嘌呤核糖核苷三磷酸)GTP是生物體內(nèi)游離存在的另一種重要的核苷酸衍生物。它具有ATP類似的結(jié)構(gòu),也是一種高能化合物。GTP主要是作為蛋白質(zhì)合成中磷?；w。在許多情況下,ATP和GTP可以相互轉(zhuǎn)換。

cAMP和cGMPcAMP(3’,5’-環(huán)腺嘌呤核苷一磷酸)和cGMP(3’,5’-環(huán)鳥嘌呤核苷一磷酸)的主要功能是作為細(xì)胞之間傳遞信息的信使。cAMP和cGMP的環(huán)狀磷酯鍵是一個(gè)高能鍵。在pH7.4條件下,cAMP和cGMP的水解能約為43.9kj/mol，比ATP水解能高得多。cAMPcGMPH3’,5’-環(huán)腺苷酸3’,5’-環(huán)鳥苷酸3’-二磷酸,5’-二磷酸鳥苷巰基乙胺泛酸3’磷酸-腺苷二磷酸尼克酰胺腺苷尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸核黃素腺苷黃素腺嘌呤二核苷酸肌苷酸IMPGMP強(qiáng)力味精：5’－肌苷酸二鈉+5’－鳥苷酸二鈉第二節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)與功能一、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)堿基組成A、G、C、U（A＝U/G≡C）稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解多為單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成螺旋分子較小分類mRNA（hnRNA

核不均一RNA）tRNA

rRNA（snRNA/asRNA）少數(shù)RNA病毒RNA的類別及分布一、細(xì)胞質(zhì)RNA1、核糖體RNA(rRNA)二、細(xì)胞核RNA前體RNA（precursorRNA)；不均一核RNA(hnRNA)小RNA（snRNA)。三、線粒體RNA與葉綠體RNA四、病毒RNA類病毒植物病毒與一些腫瘤病毒2、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)3、信使RNA(mRNA)（一）、

RNA的一級結(jié)構(gòu)AMP、GMP、CMP、UMP通過3’、5’磷酸二酯鍵形成的線形多聚體。

①

組成RNA的戊糖是核糖②

RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有堿基。③

天然RNA分子都是單鏈線形分子，只有部分區(qū)域是A-型雙螺旋結(jié)構(gòu)。二、tRNA(轉(zhuǎn)移RNA)占RNA總量的15％一種氨基酸對應(yīng)最少一種RNA分子量25000左右，大約由70－90個(gè)核苷酸組成，沉降系數(shù)為4S左右。分子中含有較多的修飾成分(稀有堿基)。3‘-末端都具有CpCpAOH的結(jié)構(gòu)。5’末端大多為pG…或pC…

tRNA的結(jié)構(gòu)★二級結(jié)構(gòu)是三葉草形氨基酸臂二氫尿嘧啶環(huán)反密碼環(huán)額外環(huán)TC環(huán)（假尿嘧啶環(huán)）★倒L形的三級結(jié)構(gòu)

★tRNA的功能：●轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸：氨酰tRNA●識別密碼子●參與翻譯起始●參與基因表達(dá)調(diào)控三、rRNA（核糖體RNA）占RNA總量的80％，分子量相對較大，一般106核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所，包含60%RNA，40%蛋白質(zhì)，多數(shù)附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。原核生物真核生物核糖體rRNA核糖體rRNA30s70s50s16s5s、23s40s80s50s18s5s、5.8s、28s★rRNA的功能：●組成核糖體●參與tRNA與mRNA的結(jié)合●肽基轉(zhuǎn)移酶活性四、mRNA和hnRNA占細(xì)胞總RNA的3％～5％它是蛋白質(zhì)合成的模板。真核細(xì)胞mRNA的3‘-末端有一段長達(dá)200個(gè)核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，稱為“尾結(jié)構(gòu)”5’-末端有一個(gè)甲基化的鳥苷酸，稱為“帽結(jié)構(gòu)”?！?/p>

5’-帽子：m7G5’-ppp5’-Nm（

Nm）p-甲基鳥苷5’，5’-三磷酸●由甲基化酶催化●可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA?！窨蔀楹颂求w提供識別位點(diǎn)，使mRNA很快與核糖體結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成?！?/p>

3’-端有一段約30-300核苷酸的polyA。

●轉(zhuǎn)錄后由poly(A)聚合酶催化加尾●PolyA是mRNA由核進(jìn)入胞質(zhì)所必需的形式?！駊olyA與mRNA半壽期有關(guān)，PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。二、

DNA的結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)：脫氧核苷酸分子間連接方式及排列順序。二級結(jié)構(gòu)：DNA的兩條多聚核苷酸鏈間通過氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。三級結(jié)構(gòu)：DNA雙鏈進(jìn)一步折疊卷曲形成的構(gòu)象。一、DNA的一級結(jié)構(gòu)脫氧核糖核酸的排列順序可以用堿基排列順序表示連接鍵：3’，5’-磷酸二酯鍵磷酸與戊糖順序相連形成主鏈骨架堿基形成側(cè)鏈多核苷酸鏈均有5’-末端和3’-末端DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。寫法：5’→3’：5’-pApCpTpG-3’，或5’…ACTG…3’★

DNA一級結(jié)構(gòu)的不均一性（1）重復(fù)序列★正向重復(fù)★高度重復(fù)序列（highrepetivesequence,sateliteDNA，SSR)2-10bp/copy105-106copies/genome多為串聯(lián)重復(fù)排列（tandemrepeats)分布于著絲點(diǎn)、端粒區(qū)、結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)★中度重復(fù)序列（middlerepetitivesequence)0.1-1Kb/copy10-104copies/genome多為間隔重復(fù)rDNA\tDNA\Histonegenecluster★低拷貝重復(fù)：基因家族★單拷貝序列（singlecopysequence)★反向重復(fù)（回文序列）(invertedrepeat,palindromesequence)較長的回文結(jié)構(gòu)，可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(發(fā)夾結(jié)構(gòu))或十字形結(jié)構(gòu)較短的回文序列，可作為一種特別信號，如限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄的終止作用與回文結(jié)構(gòu)有關(guān)?！镧R象重復(fù)（mirrorrepeat)某些情況下可以三股螺旋DNA（2）富含AT的序列很多有重要調(diào)節(jié)功能的DNA區(qū)段都富含AT堿基對。特別是在復(fù)制起點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄啟動的Pribnow區(qū)，富含AT對。2.基因與基因組基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物細(xì)胞中DNA分子的最小功能單位（交換單位）。

蛋白質(zhì)（mRNA蛋白質(zhì)）產(chǎn)物tRNARNArRNA調(diào)節(jié)功能：調(diào)節(jié)基因無產(chǎn)物

作用未知結(jié)構(gòu)基因基因組（genome）：某生物體（完整單倍體）所含全部遺傳物質(zhì)的總和。包括：核基因組（擬核/核DNA）及核外（質(zhì)粒/質(zhì)體DNA）bp（堿基對）

103104105106107108109101010111012人兩棲類魚類藻類酵母細(xì)菌E.Coli病毒質(zhì)粒各種細(xì)胞、病毒和細(xì)菌質(zhì)粒中基因組的大小3.原核生物基因組特點(diǎn)

重復(fù)序列少，多位編碼區(qū)多為操縱子形式組織有重疊基因存在真核生物基因組特點(diǎn)以染色體存在重復(fù)序列多基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject，HGP）酵母基因組計(jì)劃（YGP）大腸桿菌（E.Coli）二、DNA的二級結(jié)構(gòu)DNA的雙螺旋模型1953年，J.Watson和F.Crick在前人研究工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)DNA結(jié)晶的X-衍射圖譜和分子模型，提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，并對模型的生物學(xué)意義作出了科學(xué)的解釋和預(yù)測。在DNA分子中，嘌呤堿基的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù)相等。雙螺旋結(jié)構(gòu)模型(B-DNA)★兩條反平行的多核苷酸鏈繞同一中心軸相纏繞，形成右手雙股螺旋，一條5’→3’，另一條3’→5’★磷酸與脫氧核糖彼此通過3‘、5‘-磷酸二酯鍵相連接，構(gòu)成DNA分子的骨架?！锪姿崤c脫氧核糖在雙螺旋外側(cè)，嘌呤與嘧啶堿位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)?！飰A基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行★每圈螺旋含10個(gè)核苷酸，堿基堆積距離0.34nm，雙螺旋平均直徑2nm，2.0nm小溝大溝雙螺旋結(jié)構(gòu)模型(B-DNA)★兩條核苷酸鏈之間依靠堿基間的氫鍵結(jié)合在一起?！飰A基互補(bǔ)★螺圈之間主要靠堿基平面間的堆積力維持雙螺旋結(jié)構(gòu)模型(B-DNA)★大溝：寬1.2nm，深0.85nm，小溝：寬0.6nm，深0.75nmA型結(jié)構(gòu)堿基平面傾斜20o，螺旋變粗變短，螺距2～3nm。RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)。Z型結(jié)構(gòu)左手螺旋，外形細(xì)長。天然B-DNA的局部區(qū)域可以形成Z-DNA。類型旋轉(zhuǎn)方向螺旋直徑（nm）螺距（nm）每轉(zhuǎn)堿基對數(shù)目堿基對間垂直距離（nm）堿基對與水平面傾角A－DNAB－DNAZ－DNA右右左2.02.31.82.83.44.51110120.2550.340.2720o0o7o2、穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素①堿基堆積力（疏水相互作用及范德華力）形成疏水環(huán)境（主要因素）。②堿基配對的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。③磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負(fù)電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。④堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。（4）

三股螺旋DNA通常是一條同型寡核苷酸與寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸雙螺旋的大溝結(jié)合：oligo(Py):oligo(Pu)—oligo(Py/Pu)T=A:A,C≡G：C+T=A:TC≡G：G三股螺旋DNA中的Hoogsteen-bonding★當(dāng)DNA的一段寡嘧啶（寡嘌呤）構(gòu)成鏡像重復(fù)時(shí)可以形成三股螺旋（鉸鏈DNA，hingedDNA,H-DNA)★DNA三股螺旋結(jié)構(gòu)常出現(xiàn)在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組的起始位點(diǎn)或調(diào)節(jié)位點(diǎn)，如啟動子區(qū)。第三股鏈的存在可能使一些調(diào)控蛋白或RNA聚合酶等難以與該區(qū)段結(jié)合，從而阻遏有關(guān)遺傳信息的表達(dá)。G-四聯(lián)體螺旋結(jié)構(gòu)真核生物染色體端粒中富含G序列，易形成G－四聯(lián)體螺旋結(jié)構(gòu)二、DNA的三級結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋的進(jìn)一步扭曲構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)原核雙鏈環(huán)狀DNA（dcDNA）病毒單鏈環(huán)狀DNA（scDNA）單鏈線性DNA（ssDNA）

1、

環(huán)狀DNA的三種典型構(gòu)象（1）、

松弛環(huán)形DNA線形DNA直接環(huán)化（2）、

解鏈環(huán)形DNA線形DNA擰松后再環(huán)化（3）、

正超螺旋與負(fù)超螺旋DNAL＝T＋W連環(huán)數(shù)纏繞數(shù)超螺旋數(shù)①連環(huán)數(shù)（linkingnumber,L）DNA雙螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)②纏繞數(shù)（twistingnumber,T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋數(shù)目③超螺旋數(shù)（纏繞數(shù),writhingnumber,W）連環(huán)數(shù)（L）纏繞數(shù)（T）扭曲數(shù)W松馳環(huán)25250解鏈環(huán)23230超螺旋2325-2L=T+W負(fù)超螺旋DNA是由于兩條鏈的纏繞不足引起（L），很易解鏈，易于參加DNA的復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄等負(fù)超螺旋：超螺旋方向與雙螺旋方向相反。天然DNA都呈負(fù)超螺旋

拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA拓?fù)洚悩?gòu)體的L值。①拓?fù)洚悩?gòu)酶酶I（解旋酶）能使雙鏈負(fù)超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成松馳形環(huán)狀DNA，每次催化使L值增加1。②拓?fù)洚悩?gòu)酶酶II（促旋酶）能使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成負(fù)超螺旋形DNA，每次催化使L減少2。真核雙鏈線性DNA（dsDNA）DNA的存在形式從DNA到染色質(zhì)絲，DNA壓縮了近100倍，若從DNA到最后凝縮成染色體，DNA壓縮了近萬倍。螺旋管組蛋白八聚體：H2AH2BH3H4各2個(gè)分子染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)第五節(jié)核酸的性質(zhì)一、一般的理化性質(zhì)兩性解離/一般呈酸性（在中性溶液中帶負(fù)電荷），微溶于水，不溶于有機(jī)溶劑線性大分子（粘度高?？辜羟辛Σ睿┛捎秒娪净螂x子交換（色譜）進(jìn)行分離室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解加熱條件下，D－核糖＋濃鹽酸＋苔黑酚綠色

D－2－脫氧核糖＋酸＋二苯胺藍(lán)紫色二、核酸的紫外吸收特性在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨(dú)特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。以A260/A280進(jìn)行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外下發(fā)出熒光鑒定純度純DNA的A260/A280應(yīng)為1.8（1.65-1.85）純RNA的A260/A280應(yīng)為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。判斷DNA是否變性在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大（增色效應(yīng)）在DNA的復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減?。p色效應(yīng)）摩爾吸光系數(shù)：每升含一摩爾磷的核酸溶液（pH＝7）的消光系數(shù)三、核酸的變性、復(fù)性與分子雜交1.變性穩(wěn)定核酸雙螺旋次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。變性表征生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應(yīng)）變性因素

pH（>11.3或<5.0）變性劑（脲、甲酰胺、甲醛）低離子強(qiáng)度加熱DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達(dá)最大量一半時(shí)的溫度稱熔解溫度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之間。2.熱變性和Tm影響DNA的Tm值的因素①DNA均一性。均一性高，變性的溫度范圍越窄，據(jù)此可分析DNA的均一性。②G-C含量與Tm值成正比。測定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44③介質(zhì)中離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度高，Tm高。3.核酸的復(fù)性變性核酸的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。變性的DNA緩慢冷卻時(shí)可復(fù)性，因此又稱為“退火”。退火溫度＝Tm－25℃復(fù)性影響因素片段濃度/片段大小/片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）/溶液離子強(qiáng)度4.分子雜交DNA單鏈與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNA單鏈或RNA鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。Southern雜交（Southernbolting）Northern雜交（Northernbolting）Western雜交（Westernbolting）1、

SouthernBlottingDNA樣品→酶切→電泳→堿變性→轉(zhuǎn)膜→固定→雜交→洗滌→放射自顯影SouthernBlotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位。2、

NorthernBlotting研究對象是mRNA，探針一般是DNA。總RNA或mRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）3、

WesternBlotting抗原與抗體的雜交研究克隆基因表達(dá)產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術(shù)。Easternblot?一、

核酸的分離純化和定量盡可能保持其天然狀態(tài)，防止降解和變性。條件溫和，防止過酸、過堿、劇烈攪拌。抑制核酸酶。

核酸研究技術(shù)（一）、

DNA分離純化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl），據(jù)此，采用高鹽提取，低鹽沉淀，可將DNP與RNA核蛋白分開，提取出DNP。DNP可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質(zhì)。還可用SDS法，氯仿異戊醇法去除蛋白質(zhì)。水相中的DNA可被0.3MNaAC-無水乙醇沉淀（二）、RNA的制備★RNase的滅活：玻璃器皿：140-200，8小時(shí)塑料器皿：0.1%DEPC，37，過夜緩沖液飽和酚直接提取RNA提取液加鹽酸胍或異硫氰酸胍反應(yīng)體系中加RNasin等特異的RNase抑制劑對不同的RNA應(yīng)該先提取細(xì)胞器，然后再從細(xì)胞器中提取目標(biāo)RNA核苷酸、核苷的分離1、離子交換法2、凝膠過濾（三）、核酸的定量1、紫外分光光度法2、定磷法：DNA/RNA3、定糖法：RNA核糖糠醛綠色濃HCl/H2SO4地衣酚DNA脫氧核糖藍(lán)色冰醋酸/濃H2SO4二苯胺強(qiáng)酸無機(jī)磷磷鉬酸還原藍(lán)色4、瓊脂糖凝膠電泳核酸純度的測定紫外吸收法A260/A280

<1.8蛋白或酚污染=1.8純DNA>1.8RNA污染=2.0純RNA核酸的沉降特性與超速離心不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用CsCl密度梯度離心可以將不同構(gòu)象DNA、RNA與蛋白質(zhì)區(qū)分開來這一方法常用于質(zhì)粒DNA的純化。RNA＞DNA變性DNA＞雙鏈DNA＞蛋白質(zhì)，變性程度越大，浮力密度越大三、

核酸的凝膠電泳（一）、

瓊脂糖電泳用于大片段DNA的分離，精度低，但分離范圍廣★影響遷移率的因素：①

核酸分子的大小，遷移率與分子量的對數(shù)成反比②

凝膠濃度③

DNA的構(gòu)象，超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢。④

電壓，不大于5V/cm★染色：0.5ug/mlEB★RNA的瓊脂糖凝膠電泳一般要加入甲醛或戊二醛★瓊脂糖電泳可以用于DNA分子量的測定★瓊脂糖電泳可以用于DNA的制備與純化（二）、

PAGE電泳用于小片段DNA的分析，精度非常高一、核酸的水解（一）酸水解★對酸的敏感性：糖苷鍵＞磷酸酯鍵嘌呤糖苷鍵＞嘧啶糖苷鍵★脫嘌呤：pH1.6，37℃，對水透析pH2.8，100℃，1h★脫嘧啶：98-100%甲酸，175℃，2h三氟乙酸，155℃，60min（DNA）或80min（RNA）★利用酸水解可以研究核酸的堿基組成（二）、

堿水解★RNA的磷酸酯鍵對堿敏感室溫，0.3~1mol/LKOH，24h，可將RNA完全水解，得到2’-或3’-核苷酸的混合物?！顳NA抗堿水解★生理意義：DNA更穩(wěn)定，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后迅速降解。（三）、

酶水解★非特異的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸★特異