《泛解酸內(nèi)酯水解酶的固定化（論文）》

泛解酸內(nèi)酯水解酶的固定化研究TOC\o"1-3"\h\u28734引言 3260091.D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的固定化概述 4142391.1D-泛解酸內(nèi)酯概念 4255941.2酶的固定化方法 434751.2.1離子吸附法 47641.2.2凝膠包埋法 445032.試驗與方法 422852.1實驗器材 5108542.1.1菌種 573592.1.2培養(yǎng)基 5148102.1.3主要藥品 5237522.1.4主要儀器 5166902.2實驗方法 5144672.2.1菌絲體發(fā)酵培養(yǎng) 5792.2.2粗酶液的制備 534202.2.3樹脂轉型 6122432.2.4載體選擇方法 6181202.2.5紅外光譜的測定 6136472.2.6酶的固定化方法 610823.結果 6271123.1D-泛解酸內(nèi)酯水解酶提取方法的選擇 770993.3固定化載體的選擇 738684.討論 7179554.1固定化條件 7108774.2固定化酶的酶學性質 8272144.3固定化酶轉化工藝 82222參考文獻 9引言D-泛解酸內(nèi)酯水解酶具有很高的立體選擇性，可用于分離D-泛解酸內(nèi)酯。根據(jù)專利文獻，產(chǎn)生D-泛解酸內(nèi)酯的微生物主要有以下幾種：鐮刀菌、赤霉素、格列克拉菌、黑曲霉和圓柱藻等，其中尖孢鐮刀菌和串珠鐮刀菌已工業(yè)化[1]。D-泛酸內(nèi)酯是一種重要的醫(yī)藥中間體，主要用于合成維生素D-泛酸和神經(jīng)營養(yǎng)性D-泛酸鈣。D-泛醇和D-泛酸鈣分別與β-氨基丙醇和β-氨基丁酸反應合成外消旋體并進行拆分[2]。然而，這條路線在工業(yè)生產(chǎn)中還沒有報道。主要原因是該方法將損失近兩倍于β-氨基丙醇和β-氨基丁酸的成本，導致生產(chǎn)成本高。近年來，在國內(nèi)外D-泛酸和D-泛酸鈣工業(yè)中，首先分離DL-泛酸內(nèi)酯，直接合成D-泛酸醋及其中間體。D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的研究始于20世紀90年代。1994年從日本分離純化了尖孢鐮刀菌中的D-泛解酸內(nèi)酯，研究了該酶的反應條件，確定了酶轉化的最佳反應條件，同時測定了該酶的分子量和亞基組成[3]。2002年，Sakamoto等人在日本發(fā)表了真核生物D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的基因序列，并將修飾后的基因轉入原核生物細胞進行過表達。表達產(chǎn)物具有D-泛解酸內(nèi)酯的立體定向拆分活性。該表達產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)取得了良好的效果。本研究主要通過實驗探究D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的固定化，選擇合適的固定化載體和固定化方法記憶固定化條件。為目前的D-泛解酸內(nèi)酯水解酶固定化提供一定的參考。1.D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的固定化概述1.1D-泛解酸內(nèi)酯概念D-泛解酸內(nèi)酯是生產(chǎn)D-泛酸鈣、D-泛酸、D-泛酸乙胺等泛酸系列產(chǎn)品的重要手性中間體，泛酸是B族維生素物質，是輔酶a的組成部分，參與糖、脂肪和蛋白質的代謝。泛酸是輔酶A的輔酶，輔酶A是泛酸與3-磷酸腺苷、焦磷酸和r-賴乙胺的復合分子。因此，輔酶A在泛酸的生理功能中起著重要作用：它參與體內(nèi)脂肪酸降解、脂肪酸合成、檸檬酸循環(huán)、膽堿酯酶（一種神經(jīng)遞質）乙基化、抗體合成（增強對病原體的抵抗力）等代謝。由于輔酶A的生理功能，泛酸的存在有利于各種營養(yǎng)物質的吸收和利用。因此，D-泛酸廣泛應用于醫(yī)藥、食品和飼料工業(yè)。其活性成分為右旋泛酸（維生素B3）的D-構型，但由于泛酸的不穩(wěn)定性，其商業(yè)形態(tài)主要為D-泛酸鈣。D-泛酸（provitaminB5）是一種液態(tài)D-泛酸鈣，進入動物體內(nèi)可轉化為泛酸。由于泛酸在ph3-5時比泛酸鹽具有更好的穩(wěn)定性，因此在多維生物溶液中用泛酸代替泛酸。1.2酶的固定化方法1.2.1離子吸附法采用離子效應將酶固定在帶離子交換基的水不溶性載體上。除了具有離子交換基團的多糖外，聚電解質，如離子交換樹脂，也可以用作合成聚合物衍生物的載體。與上述共價結合法相比，離子結合法更方便，處理條件溫和，酶的高級結構和活性中心的氨基酸很少發(fā)生變化，因此可以得到高活性的固定化酶。但與共價鍵合等化學方法相比，載體與酶的鍵合依賴于庫侖相互作用，因而不夠牢固，易受所用緩沖液和反應液pH值的影響。當溶液的離子強度較高時，由于去屏蔽作用，酶會從載體上脫落。1.2.2凝膠包埋法在不溶性凝膠的空隙中嵌入酶的方法。操作中先將酶與單體混合，再加入引發(fā)劑使單體聚合，制備凝膠固定化酶。交聯(lián)多酚凝膠包封是第一種包埋技術。固定化酶包括胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、p-淀粉酶。后來，一些研究者用這種方法固定過氧化氫酶、糜蛋白酶、p-糖化酶。近年來，一些研究者利用海藻酸鈉和卡拉膠（k-卡拉膠）等天然材料進行固定化?？ɡz是從卡拉膠中提取的一種多糖。酶的水溶液在40-60攝氏度的生理鹽水溶液中與卡拉膠混合。冷卻后形成凝膠，凝膠在0.3mol/L氯化鉀溶液中硬化，硬化后的凝膠形成合適大小的顆粒，即固定化酶。用單寧、戊二醛、己二胺等固化劑對固定化酶進行處理，可以得到更穩(wěn)定的固定化酶。該方法適用于多種酶的固定化。2.試驗與方法2.1實驗器材2.1.1菌種腐皮鐮飽菌(Fl訴ratumAS3.4738)2.1.2培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基（察氏培養(yǎng)基）：NaNO30.3%,KCI0.05%，K2HPO40.1%,FeSO40.001%，MgS04.7H2O0.05%,庶糖3%，瓊脂2%，pH6.7,12rC滅菌15min。種子培養(yǎng)基：甘油2%，蛋白胨1%,酵母膏1%，玉米衆(zhòng)1%，pH6.7。發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油3%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，玉米菜0.5%，pH6.7。2.1.3主要藥品25%戊二酵水溶液、瓊脂粉、DL-泛解酸內(nèi)離標準品、D-泛解酸內(nèi)酯、可溶性淀粉、乙醇等。2.1.4主要儀器HYG-II型回轉式恒溫調速搖床、HS-1300-V型超凈臺、AB204-S型分析天平、CHB型普通光學顯微鏡、高速冷凍離心機等。2.2實驗方法2.2.1菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)斜面和茄子瓶種子的培養(yǎng)取菌種封管在茄子瓶斜面上劃線接種，于28℃下培養(yǎng)5天，連續(xù)傳至3代，40C冰箱保存?zhèn)溆?。種子培養(yǎng)用無菌水將茄子瓶斜面菌體細胞洗下，制成菌懸液(抱子數(shù)1.0X1護cell/mL-1.0X1Ogcell/mL)，30mL種子培養(yǎng)基接入3mLa28℃180r/min搖床震蕩培養(yǎng)16-18h，裝液量30mL/250mL。發(fā)酵培養(yǎng)以5%接種量將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的種子接入裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，28℃，180r/min，培養(yǎng)48h。2.2.2粗酶液的制備菌絲體收集將培養(yǎng)好的發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾，將所得菌絲體空氣吹干控制水分在30-40%所得菌絲冷凍保藏，備用。破壁提取取菌絲100g，冰浴環(huán)境下，球磨機轉速50r/min，研磨時間15min，得菌絲泥。加菌絲泥體積10倍量冰水稀釋，經(jīng)高壓勻質機，壓力0.15MPa，勻質破壁，10000r/min時間10min，冷凍離心上清即為酶液，冰箱冷藏，備用。超濾濃縮取上述酶液，在壓力0.15Mpa經(jīng)2000的超濾膜澄清，再在壓力0.15Mpa經(jīng)500000的超濾膜截留分子量50KD的蛋白，將超濾后的粗酶提取液放入冰箱保藏備用。2.2.3樹脂轉型樹脂轉型有靜態(tài)和動態(tài)兩種方法，本實驗采用靜態(tài)法把離子交換樹脂轉成C1型:取一定量的樹脂，經(jīng)去離子水清洗多次，再用4%NaOH浸泡4h后，去離子水清洗多次至中性，再用4%HC1浸泡4h，用去離子水清洗多次至中性，用2倍體積以上去離子水浸泡備用。2.2.4載體選擇方法取處理過的樹脂載體1g，分別加入適當?shù)拿附庖汉瓦m當?shù)腡ris-HCI緩沖液privateI-CACI溶液，在30℃120R/min恒溫水浴搖瓶中搖過夜，丟棄Tris-HCl緩沖液，反復洗滌，直至洗滌液中無酶活為止。分別測定固定化酶和上清液的酶活，計算固定化酶的回收率。2.2.5紅外光譜的測定將未經(jīng)酶吸附和酶吸附處理的樹脂在凍干機（-6q0c）中冷凍48小時。然后將凍干的樣品放入瑪瑙砂漿中，與磨碎的KBr混合，壓入透明片中，以250C.Kb:為背景光譜進行紅外測試。2.2.6酶的固定化方法以戊二醛為交聯(lián)劑取一定量的預處理樹脂，用濾紙將表面水吹干，稱取1g樹脂放入250毫升三角瓶中，加入適量的Tris-HCl緩沖液和酶溶液，放入恒溫水浴搖瓶中吸附。吸附后放入4℃冰箱冷卻。待溫度與戊二醛相當后，加入一定濃度的戊二醛溶液，緩慢攪拌。最后放入低溫恒溫反應槽中交聯(lián)。交聯(lián)后用去離子水清洗樹脂，去離子水體積約為樹脂吸附劑體積的10倍，去除游離酶。清洗后的樹脂為固定樹脂。將固定化樹脂在一定pH的Tris-HCl緩沖液中浸泡，放入冰箱備用。以THP為交聯(lián)劑取一定量的80%（w/V）THPC溶液，加入95ml去離子水，在劇烈攪拌下，滴加一定濃度的KOH溶液5ml，保證THP和KOH為等摩爾反應，然后快速加入0.5g預處理樹脂，緩慢攪拌5分鐘，用去離子水清洗樹脂3次后，加入一定量的Tris-HCl緩沖液（0.02mol/L），調節(jié)D-pan水解酸內(nèi)醋酸水解酶溶液的pH值，放入恒溫搖瓶中一定時間，最后用去離子水清洗。所得樹脂為固定樹脂。用少許去離子水浸泡后放入冰箱備用。3.結果3.1D-泛解酸內(nèi)酯水解酶提取方法的選擇由于D-泛醇內(nèi)酯水解酶存在于增殖鐮刀菌（Fusariumproliferanumvar，proliferatumas3.4738）中，因此有必要破壁獲得d-泛醇內(nèi)酯水解酶。因此，根據(jù)2.3.2的方法提取D-泛解酸內(nèi)酯水解酶。表3-1幾種粗酶提取方法的對比提取方法提取前酶活力(U/g)提取后酶活力(U/g)酶活提取率(%)液氮研磨法0.230.1357.58超聲破碎法0.230.1253.79高壓均質法0.230.1356.97由表3-1可知，高壓均質法提取d-泮托拉酮水解酶的提取率為56.97%，液氮研磨法提取d-泮托拉酮水解酶的提取率為57.58%，兩種方法無顯著差異。但從菌絲體加工能力來看，高壓均質法處理能力大（約2kg/h），超聲波破碎提取法和液氮研磨法處理能力?。s0.01kg/h）。綜合考慮，如果在大型工礦生產(chǎn)中采用高壓均質法，是必然的。因此，選擇高壓均質法作為粗酶的提取方法。與粉碎前的菌絲相比，粉碎后的菌絲體結構明顯減少，而且還存在一個小片段結構，說明粉碎效果較好。超濾是一種加壓膜過濾。其工作原理是使膜側（原液中）的大溶質分子保持恒壓，而小溶質分子則滲透到膜的另一側，從而達到分離、純化和濃縮產(chǎn)品的目的。超濾技術適用于生物大分子發(fā)酵產(chǎn)物的提取、純化和濃縮。該工藝具有成本低、操作方便、條件溫和、酶活性好、產(chǎn)品回收率高等優(yōu)點。3.3固定化載體的選擇本研究選用6種有代表性的樹脂D-3520,D-152.D-380,N-KA9,AB-8,ADS-76種材料按上述方法，加酶量為6U/g樹脂，在300C,PH為7.5，恒溫吸附4h，然后測定固定化酶活和酶活回收率。其固定化效果如表3-2。表3-2載體對固定化酶活力的影響樹脂D-3520D-152D-380N-KA9AB-8ADS-7酶活回收率33.1754.3056.8740.7344.1750.17酶活(U/g載體)42.762.873.12從表3-2可以看出，離子交換樹脂比吸附樹脂具有更大的優(yōu)勢。這可能是由于吸附樹脂，沒有官能團，D-泛酸內(nèi)水解酶的吸附只依賴于較大的比表面積，作用分數(shù)很弱，或酶的蛋白質含量太小，導致空間滲漏或酶的失活吸附過強所致，因此酶活性和活性回收率普遍較低。但是，離子交換樹脂對酶的吸附依賴于離子鍵、氫鍵和范德華引力，與吸附樹脂相比，吸附力強，不易脫落。通過戊二醛的交聯(lián)處理，提高了酶的穩(wěn)定性，易于實現(xiàn)工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)。所選樹脂中，弱堿性陰離子交換樹脂D380具有較高的固定化酶活性和回收率。結果表明，D380固定化效果最好。4.討論4.1固定化條件在300cd-380、n-ka9和pH值為7.5的條件下，在恒溫吸附4h后，比較了d-3520、d-152、AB-8和es-v-1六種樹脂吸附d-泛素內(nèi)切酶的酶活和酶回收率。結果表明，D-380具有良好的吸附效果，固定化酶活力可達4u/g樹脂，酶活力回收率可達66.7%。4.2固定化酶的酶學性質通過實驗確定了固定化酶的酶學性質：固定化酶的最適溫度為400℃，比游離酶高100℃，熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性都有一定程度的提高；固定化酶的動力學常數(shù)kn為28.2mmol/L，比游離酶的動力學常數(shù)kn高2.0mmol/L比報道的酶高6.8倍。4.3固定化酶轉化工藝考慮到D-泛解酸內(nèi)酯是一種混合旋轉的化合物，當D-泛解酸內(nèi)酯用于生成D-泛解酸時，D-泛解酸內(nèi)酯也會在適當?shù)臈l件下自發(fā)水解，并發(fā)生一些其它的副反應，從而在反應體系中增加額外的產(chǎn)物，使下一步的分離成為可能提取更困難。因此，研究固定化酶轉化為底物的工藝具有重要意義。為了最大限度地提高固定化酶水解D-泛解酸內(nèi)酯的能力，對酶水解條件進行了優(yōu)化。主要研究了以下幾個方面：（1）底物溶液的濃度。（2）固定化酶的添加量。（3）固定化酶的PH值。（4）固定化酶的溫度。（5）水解反應時間。（6）水解過程中的攪拌速度。最后，確定了固定化D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的最佳水解條件。參考文獻[1]王亞慧,侯海榮,陳明濤,孫春