第4次課天然產(chǎn)物研究實驗室技術(shù)2(純化)

提取基礎(chǔ)分離白樺酸酯合成（化學(xué)、生物轉(zhuǎn)化）第三講天然藥物活性成分的提取與分離

重要性：－－天然藥物的開發(fā)（WTO，知識產(chǎn)權(quán)）柱色譜

ColumnChromatogrphy

常壓柱色譜(0.1~50g)（OrdinaryColumnChromatogr.）吸附柱色譜分配柱色譜植物有效柱色譜離子交換柱色譜成分分離凝膠過濾柱色譜主要手段聚酰胺柱色譜大孔吸附樹脂一、吸附性色譜Al2O3orSilicagel

生物堿水溶性Al2O3甾體脂溶性Silicagel揮發(fā)油脂溶性

1裝柱Al2O3：吸附劑:樣品(20~50:1)→(20~100:1)Silica：吸附劑:樣品(30~100:1)→(300~400:1)1)干法與TLC吻合度較好，溶劑消耗少2)濕法緊密，前沿整齊2上樣1)濕法：溶劑溶解上樣（少量），低極性2)干法：低極性溶劑溶解性差3洗脫常壓、低壓、梯度洗脫4收集與檢查等份TLC、UV二、聚酰胺（Polyamide）1原理（1）氫鍵吸附原理：基于酰胺鍵酚類、酸類、醌類、硝基化合物成氫鍵能力與溶劑有關(guān)水<甲醇<乙醇<丙酮<稀氨液<稀NaOH氫鍵吸附規(guī)律：基團多少；基團位置；芳香核；共軛雙鍵；分子內(nèi)氫鍵（2）極性吸附原理：基于非極性脂肪鏈萜類、甾體、生物堿黃酮苷非水（正相）；含水（反相）2聚酰胺粉的制備國產(chǎn)（15~30目）、層析用（80~100目）粗粉蒸餾水浸泡過夜，磨細(xì)，混懸液直接使用抽濾后，60~80度烘干2~3小時備用。3操作裝柱：細(xì)粉水浸泡裝柱，自然沉降上樣：20~30%水溶液上樣，上樣量40-60:1洗脫：水、含水醇、95%醇、3%NaOH、5%NaOH4再生：5%NaOH三、分配柱色譜

1原理利用混合物在兩相互不混溶中分配系數(shù)不同，而達到分離的一種柱層析方法。分配系數(shù)差異愈大，分離效果愈好。2支持劑硅膠、硅藻土、纖維粉3溶劑系統(tǒng)的選擇PC、TLC4操作（1）裝柱（2）上樣（3）洗脫四、凝膠柱色譜（SephadexLH-20）

1葡聚糖凝膠簡介由葡聚糖凝膠SephadexG-25交聯(lián)親脂性羥丙基而制備，是同時具備吸附色譜、分配色譜和分子篩功能的獨特色譜介質(zhì)。溶劑系統(tǒng)沒有限制，包括水相緩沖液、丙酮、乙酸乙脂、氯仿、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯和各種混合溶劑。大量文獻證明它非常適合于天然產(chǎn)物純化，特別是中草藥有效成分如苷類、生物堿、黃酮、蒽醌、內(nèi)酯、帖類、甾類、多酚的分離。德國科學(xué)家HansHenke著有SephadexLH-20凝膠色譜分離專著。2原理分子篩：分子的大小和形狀吸附色譜：被分離化合物與凝膠間的氫鍵分配色譜：被分離化合物在流動相（溶劑）和固定相（凝膠）之間的分配3操作（1）裝柱洗脫劑溶脹后懸浮液攪拌裝柱。（2）上樣（3）洗脫水溶性好：水或電解質(zhì)溶液水溶性差：醇水或丙酮水極性較小：丙酮、氯仿（4）濃縮視情況而定（5）再生洗脫劑平衡有污染：0.2NNaOH→0.5NHCl浸泡水洗凈→平衡保存：50%丙酮水溶液4應(yīng)用實例川芎里的腺嘌呤貝母里的腺苷浙貝寧、茄啶日本附子里的烏頭堿銀杏黃酮苷夏枯草中的夏枯草黃酮苷、皂苷升麻中的酰胺苷水蔓菁中的水蔓菁萜苷鹿銜草中的鹿蹄草苷淫羊霍中的淫羊霍苷多種中草藥中的蘆丁蕓香苷紅花中的槲皮素、蘆丁、山柰酚、紅色素等多種黃酮麥冬中的麥冬黃酮鹿蹄草中的兒茶素紫草中的萘醌、多酚五、離子交換柱色譜1原理利用大分子樹脂網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)存在的交換基團而進行的交換性柱色譜方法。2影響離子交換的因素PH值欲交換化合物的性質(zhì)欲交換化合物的濃度溫度交換溶劑交換流速樹脂用量3樹脂的選擇4操作（1）樹脂預(yù)處理（2）裝柱（3）上樣（4）交換（5）洗脫（6）樹脂再生六、大孔吸附樹脂色譜1簡介

大孔樹脂吸附技術(shù)是上世紀(jì)七十年代發(fā)展起來的一種新工藝，是由苯乙烯、二乙烯或a-甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)。

大孔樹脂吸附色譜操作的基本程序大多是：提取液－通過大孔樹脂－吸附上有效成分的樹脂－洗脫－洗脫液回收－洗脫液干燥－半成品。藥液通過大孔樹脂吸附，其中的有效成分吸附在樹脂上，再經(jīng)洗脫回收，可除掉藥液中雜質(zhì)，是一種純化精制藥的有效方法。該技術(shù)目前已較廣應(yīng)用于新藥開發(fā)和生產(chǎn)中,主要用在分離和提純過程中。2原理：非極性吸附樹脂在吸附藥液中成分時，主要是依靠物理結(jié)構(gòu)（如比表面、孔徑等）起作用，不同的樹脂有不同的針對性。4影響分離的因素分子極性大小分子體積PH值樹脂柱的清洗洗脫液的選擇3操作（1）樹脂預(yù)處理（2）裝柱（3）上樣（4）洗脫（5）樹脂再生5優(yōu)點可有效地去除水煎液中大量的糖類、無機鹽、黏液質(zhì)等吸潮成分；有利于多種中藥劑型的生產(chǎn)，增強產(chǎn)品的穩(wěn)定性；大孔樹脂吸附技術(shù)還能縮短生產(chǎn)周期，所需設(shè)備簡單。免去了靜置沉淀、濃縮等耗時多的工序。6實際應(yīng)用

適合中等程度的水溶性化合物：天然色素，從發(fā)酵液中得到抗生素（青霉素、先鋒霉素、螺旋霉素）、蛋白質(zhì)（胰島素、肽系抗生素）、功能性食品添加劑（維生素）等。聚苯乙烯合成吸附樹脂吸附含有π電子的化合物，如含有苯環(huán)和共軛雙鍵的化合物；甲基丙烯酸甲酯類吸附劑吸附含羧基、酯基、氨基、酰胺基等與H可結(jié)合的官能團的化合物。

特殊柱色譜（SpecialColumnChromatogr.）

干柱柱色譜減壓柱色譜植物有效成分特殊柱層析短柱柱色譜分離新方法閃式柱色譜棒色譜

一、干柱柱色譜1簡介2特點（1）優(yōu)點分離效果比濕法裝柱高；可用薄層最佳分離條件直接套用；對有熒光或顏色的物質(zhì)，可在紫外燈下將已分離的各層帶分別切開，避免常規(guī)液相層析中因流出液收集不當(dāng)而造成的層帶交叉；適用于制備性分離；設(shè)備簡單，消耗溶劑少，工時省，（2）缺點樣品容量比濕法裝柱小，因此，消耗填充劑量大。（1）填充劑種類氧化鋁活性III~V吸附色譜硅膠活性II~III干柱聚酰胺色譜分配色譜3原理與薄層色譜相同，借顆粒間的孔隙所產(chǎn)生的毛細(xì)作用而展層，因此，可套用薄層條件，分離效果亦相同。干填充劑顆粒的深孔內(nèi)充滿空氣，溶劑和樣品分子很難進入顆粒的深孔，吸附與解吸主要在外部表面進行。克服了樣品分子由于進出填充劑深孔所造成的擴散及傳質(zhì)緩慢，因此其柱效比濕裝柱高。（2）展開劑多采用混合溶劑避免溶劑解混產(chǎn)生，影響分離效果

解決辦法：搭配極性相差適當(dāng)?shù)娜軇┤纾菏兔眩颐崖确拢掖际兔眩掖悸确拢状甲⒁猓罕?、苯酚等溶劑對紫外光燈檢出層帶有影響。（3）分離條件探索探索和選擇對樣品分離度最大的填充劑和展開劑薄層色譜（最佳分離條件）（4）樣品容量1:100~1:300樣品只能與吸附劑的外部表面接觸

4操作（1）柱的制備（常用50cm）聚乙烯薄膜柱玻璃柱（2）加樣和展開加樣：溶液加樣；拌樣加樣展開（3）層帶的定位及分割

二、減壓柱色譜（抽柱VacuumLiquidChromatography)1簡介

簡便、實用、快速的色譜方法，其基本原理與吸附層析相同，適用于較大量的制備性分離或提取物的極性分段劃分。（粗分）2操作

G-4垂熔玻砂漏斗或短粗柱、磨底抽濾瓶、減壓泵及分部收集瓶組成。裝柱上樣洗脫收集3注意事項真空度：20~70mmHg洗脫劑極性：由小到大梯度遞增交叉色帶4應(yīng)用二萜生物堿的分離黃酮類化合物的分離三、短柱柱色譜短柱柱色譜在制備量分離方面有獨到之處，在微量成分的富集上有一定實用價值。1短柱色譜理論經(jīng)典色譜理論：柱效隨柱徑的加大而下降，柱子愈長，分離越好，柱效越高。近來研究發(fā)現(xiàn)，此理論有一定局限性，在實踐基礎(chǔ)上，提出新的觀點：柱徑加大后，在適當(dāng)條件下柱效反而提高。（1）適當(dāng)條件：柱徑：3~20cm短粗柱柱長：5~30cm（2）原因1)Knox提出“無限直徑效應(yīng)”，認(rèn)為柱短，柱徑相對較粗，層析相對集中于中部進行，消除或減少了“柱壁效應(yīng)”。2）柱短，可使洗脫液在柱內(nèi)受阻減少，且截面增大，使自然流速大大增加，為采用高細(xì)度吸附劑提供了可能條件。2色譜方法同普通柱色譜，不同之處在于采用短粗柱，使用吸附劑粒度細(xì)小，且粒度范圍窄，裝柱應(yīng)盡量均勻。洗脫時多采用梯度洗脫，對洗脫劑選擇較嚴(yán)格。3注意事項填料、洗脫劑Rf>0.2預(yù)純化操作四、閃式柱色譜（FlashChromatography)

20世紀(jì)70年代后發(fā)展起來的一種快速柱色譜技術(shù)。1簡介柱短，分離時間短，快，分離效率高。閃式硅膠（FlashSicicagel）進口，國產(chǎn)（山東即墨化學(xué)試劑廠）球型微粒，粒度在40-63μm（230-400目）之間（均勻）加壓色譜0.3-1Kg/cm210mg-10g樣品10-15min2操作

與普通柱色譜法基本相同。裝柱：濕法干法（20cm）上樣：拌樣濕法洗脫：Rf0.2-0.3加液8-10cm，加壓3實際應(yīng)用皂苷、甾體、生物堿、黃酮五、棒色譜（StickChromatography)1簡介

與制備型薄層色譜原理相同,分離量大。把硅膠、氧化鋁等制成園柱形的棒，下端上樣，上行展開而達到分離目的。2操作

制棒上樣展開引導(dǎo)座－－兩端相通，內(nèi)填層析硅膠展開裝置－－層析槽，密封罩收集3應(yīng)用生物堿、皂苷、甾醇等加壓柱色譜（PressureLiquidChromatogr.）類型

低壓柱色譜加壓柱層析中壓柱色譜高壓柱色譜優(yōu)點

分離因子a高，故能完成復(fù)雜的分離過程（a=兩組分的相對保留時間之比，分離因子是評價色譜柱選擇性的一種指標(biāo)）

制備型與分析型的區(qū)別：分析型：不要求樣品回收制備型：要求樣品載量高，因此便要求有特殊的層析裝置和操作系統(tǒng)基本原理1加壓柱色譜效果Speed分析型制備型ResolutionLoad與Load相關(guān)的因素柱徑、柱長、粒度、填充劑密度

2加壓柱色譜目的得到單體化合物L(fēng)ab.一定純度生產(chǎn)規(guī)?；厥章蕟挝粫r間內(nèi)分得的化合物量

洗脫液流速快可用更細(xì)的顆粒，分辨率提高避免不穩(wěn)定化合物在開口柱上由于長時間暴露而導(dǎo)致分解（最大優(yōu)點）3分類（Classifcaton）AnalyticalHPLC:μg－<5mgPrep.HPLC:5mg－1gLow-pressureLC:10mg－1gMedium-pressureLC:100mg－100g

選擇制備型系統(tǒng)需要考慮：以上各法的極限（適應(yīng)范圍）根據(jù)以上條件要求而選用的方法上樣量：質(zhì)量超載（少量樣品）or體積超載（多量樣品）柱尺寸，固定相粒度，壓力，洗脫劑經(jīng)驗積累4操作TLC探索條件（色譜系統(tǒng)選擇）分析型小試優(yōu)化條件（超載）套用優(yōu)化條件（制備）正式操作獲得純品分析鑒定純品再生柱：5倍柱體積正相：actone—water—methanol—THF－dichloromethane反相：water－methanol5Prep.LC的各種條件的應(yīng)用情況及優(yōu)化（1）Column:loading,f,size,columnefficiency,a,K’numberoftheoreticalplates,resolution（2）Stationaryphase:固—液、粒度大小硅膠－普通、鍵合相AgNO3—coatedsilicagel－涂層AgNO3分離萜類—分開不同雙鍵數(shù)目或位置Paired-ionChromatogr.－生物堿在柱上增加一種離子，該離子與欲分離物相反，從而成為離子對，而成中性，易分離Chiralstationaryp