臨床微生物檢驗與臨床課件

臨床微生物檢驗

與臨床機遇與挑戰(zhàn)并存感染病因的復(fù)雜免疫力低下的人群急劇上升全民關(guān)注感染問題相關(guān)部門的重視未知病原的鑒定臨床要求有效時間內(nèi)的有效報告細菌檢驗人員技術(shù)面和設(shè)備不能滿足臨床要求信任危機現(xiàn)代感染的特點新感染性疾病:SARS、禽流感、豬流感已被征服的疾病卷土重來：結(jié)核、性病、炭疽低免疫人群急劇上升：艾滋病、移植患者動物微生物向人類的襲擊細菌耐藥、經(jīng)驗性用藥失敗、細菌培養(yǎng)陽性率低、細菌報告至少3天，離8h出報告相差很遠微生物學(xué)發(fā)展中的大事件迷茫時代很早以前中國人就知道了有些疾病可以傳染，但認為是由不可見的“神”或“鬼”引起古埃及、古印度也有同樣的傳說到我國明代李時珍的《本草綱目》中就有了將病人穿過的衣服蒸過以后再穿就不會傳染疾病的記載

直到17世紀后期發(fā)明了顯微鏡后才真正觀察到了微生物的存在

顯微鏡問世揭開了微生物檢驗的序幕

1676年荷蘭人虎克創(chuàng)制了一臺能放大200-300倍的顯微鏡，發(fā)現(xiàn)了許多肉眼看不見的微小生物，并正確地描述了微生物的形態(tài)有球形、桿狀、螺旋體等，為微生物的存在提供了證據(jù)微生物學(xué)發(fā)展中的大事件

巴士德開創(chuàng)造了微生物的生理學(xué)時期

直到19世紀60年代，法國科學(xué)家巴士德發(fā)明了加溫處理物品的巴氏消毒法，證明了有機物的發(fā)酵和腐敗是微生物作用的結(jié)果，開始了微生物的生理學(xué)時期，人們認識到不同微生物間不僅有形態(tài)學(xué)上的差異，在生理學(xué)特性上亦有所不同虎克發(fā)現(xiàn)了微生物的存在，但缺乏基本的認識和技術(shù)，微生物的研究仍長期停滯，經(jīng)歷了近200年的漫長過程微生物學(xué)發(fā)展中的大事件

微生物學(xué)創(chuàng)立及發(fā)展

德國醫(yī)生郭霍創(chuàng)用了固體培養(yǎng)基分離細菌和細菌染色法，使他和巴士德一道成為實驗微生物學(xué)的奠基人，并提出了著名的郭霍法則此后，微生物學(xué)才真正創(chuàng)立并極大的發(fā)展自郭霍法則提出后20年是細菌學(xué)發(fā)展的黃金時代，相繼分離出炭疽桿菌，結(jié)核桿菌，霍亂弧菌，白喉桿菌，傷寒桿菌，腦膜炎球菌，破傷風(fēng)桿菌，鼠疫桿菌，痢疾桿菌等微生物學(xué)發(fā)展中的大事件

病毒的發(fā)現(xiàn)

1892年俄國科學(xué)家伊凡洛夫斯基發(fā)現(xiàn)了一種可通過細菌濾器的最微小生物-病毒

微生物學(xué)發(fā)展中的大事件

磺胺的發(fā)現(xiàn)

1907年Gelmo在研究偶氮染料時制成了氨苯磺胺（最初時作為一種紅色的染料），1935年杜瑪克（domagk）將磺胺應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，1936年用于臨床，當(dāng)時主要是治療A組β-溶血性鏈球菌所致的產(chǎn)褥熱，使病死率顯著下降，于1939年榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎微生物學(xué)發(fā)展中的大事件二戰(zhàn)時的一張張貼畫，標志著抗生素時代的到來微生物學(xué)發(fā)展中的大事件

抗生素的發(fā)現(xiàn)

1944年Waksman自灰鏈霉菌培養(yǎng)中分離出可拮抗結(jié)核桿菌的鏈霉素，于1952年榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎1947年發(fā)明氯霉素1947年發(fā)現(xiàn)多粘菌素1948年發(fā)現(xiàn)金霉素1949年發(fā)現(xiàn)新霉素

1950年發(fā)現(xiàn)土霉素。。。微生物學(xué)發(fā)展中的大事件1943年青霉素大規(guī)模使用，1945年院內(nèi)感染的20%金黃色葡球菌對其產(chǎn)生抗性1947年鏈霉菌素上市，同年該藥耐藥菌出現(xiàn)1952年四環(huán)菌素上市，1956年其耐藥菌出現(xiàn)1959年甲氧西林上市，1961年其耐藥菌出現(xiàn)

細菌耐藥性第一次提到了重要的日程抗生素使用與細菌耐藥變化逐步上升到用20萬、100萬、400萬、以及更高單位才能控制，甚至對青霉素產(chǎn)生耐藥性隨著抗生素特別是二代與三代頭孢菌素的廣泛使用，導(dǎo)致了多重耐藥菌的不斷增多并迅速擴散，它對許多抗生素產(chǎn)生耐藥性1943年用2萬單位青霉素就能夠控制的感染

細菌耐藥性問題再次被提到了重要的日程抗生素使用與細菌耐藥變化這些耐藥菌、尤其是多重耐藥及泛耐藥菌，已經(jīng)成為目前臨床醫(yī)生難以對付的“超級細菌”抗生素使用與細菌耐藥變化早在抗生素應(yīng)用以前有些細菌就具有抗藥基因早在人工合成的抗生素使用之前，細菌就與自然界中的一些天然抗菌成分以及其他微生物產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)廣泛接觸而獲得了耐藥基因.（如放線菌代謝產(chǎn)物、天然植物、中草藥等）抗生素使用與細菌耐藥變化細菌耐藥已成為21世紀全球關(guān)注的熱點對人類生命健康所構(gòu)成的威脅絕不亞于艾滋病，癌癥和心血管疾病防止濫用抗生素而造成耐藥菌的出現(xiàn)及快速傳播、不斷研究開發(fā)新的抗菌藥物是戰(zhàn)勝細菌耐藥的重要途徑抗生素使用與細菌耐藥變化抗菌藥物臨床應(yīng)用管理辦法第三章抗菌藥物臨床應(yīng)用管理第十六條

……三級醫(yī)院抗菌藥物品種不得超過50種；二級醫(yī)院不得超過35種，同一通用名稱藥品的品種，注射劑型和口服劑型各不得超過2種，處方組成類同的復(fù)方制劑1-2種。具有相似或相同藥學(xué)特征的藥品不得重復(fù)采購。第二十八條……醫(yī)療機構(gòu)住院患者抗菌藥物使用率不得超過50%……門診抗菌藥物處方比例不得超過15%。標本采集部位非無菌部位無菌部位眼血液耳骨髓呼吸道腦脊液腸胃道胸水泌尿道腹水皮膚關(guān)節(jié)液毛發(fā)痰（Sputum）痰液通常作為下呼吸道細菌感染的標本。痰液是一個由支氣管分泌物和炎性滲出物組成的混合物，通過口腔咳出。不管是采集合適的標本，還是解釋培養(yǎng)出的結(jié)果都存在難點。因為繁忙和技術(shù)不夠熟練或未接受培訓(xùn)的人員可能會錯誤的采集和送檢唾液到實驗室。通常需要反復(fù)送檢痰培養(yǎng)，來確認真正的致病株。標本質(zhì)量帶血痰唾液or誘導(dǎo)痰(?)膿痰粘液樣痰結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)問題，怎么辦？陽性率低？采樣部位；采樣操作；運送方式及時間；培養(yǎng)環(huán)境；在新形勢下

重新審視血培養(yǎng)明確血培養(yǎng)的臨床意義血培養(yǎng)對以下疾病很重要—菌血癥—感染性心內(nèi)膜炎

—臨床不明原因感染

—假體植入后感染（人工關(guān)節(jié)、人工瓣膜）

—靜脈導(dǎo)管相關(guān)性菌血癥

—肺炎血培養(yǎng)是最好的工具幫助他們用藥、減少死亡

指示預(yù)后健康人能在幾分鐘內(nèi)將血中菌消失病人則不能將病原菌控制在原發(fā)部位醫(yī)生未能將病原菌，如：—清除失敗

—引流不成功死亡率與病原菌、藥敏譜、基礎(chǔ)病相關(guān)，亦即提供了預(yù)后信息敗血癥由感染引起的全身感染發(fā)病率上升、在致死的主導(dǎo)因素中居第十位非冠脈意外的ICU中最多見的致死因素器官功能障礙的常見誘因不同部位感染敗血癥發(fā)生率感染情況發(fā)病數(shù)：美國和歐洲80萬/年敗血癥休克：40萬/年死亡人數(shù)：20萬/年北京協(xié)和醫(yī)院：病死率38.4%,院內(nèi)感染病死44.6%當(dāng)前血培養(yǎng)存在的問題采樣時污染嚴重培養(yǎng)一次陰性作為診斷依據(jù)血液與培養(yǎng)基比例不正確采樣時間不正確少做厭氧培養(yǎng)不能及時報告國際上仍然公認血培養(yǎng)是診斷血流感染的金標準！采血指針發(fā)熱（>38。C）或低溫（<36。C）寒戰(zhàn)白細胞增多皮膚黏膜出血昏迷多器官衰竭，血壓降低，CRP升高及呼吸快特殊患者出現(xiàn)粒細胞減少，血小板減少等皮膚消毒程序

70%酒精

1%~2%碘酊30秒或者10%碘伏消毒60秒70%酒精脫碘皮膚和環(huán)境的細菌在嚴格的消毒條件下，仍有3%~5%的污染菌”：皮膚菌表皮葡萄球菌座瘡丙酸桿菌梭桿菌屬類白喉群環(huán)境菌：革蘭陽性桿菌、不動桿菌皮膚和環(huán)境的細菌何種情況下考慮可能是菌血癥的致病菌？對兩次不同部位血培養(yǎng)生長同一種微生物其他無菌部位標本培養(yǎng)中生長同一種微生物微生物快速生長<=48小時實驗室工作人員和醫(yī)生之間進行交流溝通，結(jié)合臨床討論這些菌意義靜脈穿刺和培養(yǎng)接種程序

在穿刺或穿刺期間，不可接觸穿刺點

用注射器無菌穿刺取血后，勿換針頭，直接注入血培養(yǎng)瓶血標本接種培養(yǎng)瓶后，輕輕混勻以防止血液凝固，立即送檢血培養(yǎng)次數(shù)病特點

陽性率1套1+2套1+2+3套一般菌血癥65%80%96%感染性心內(nèi)膜炎80%2004年報告：163位病人，血培養(yǎng)儀血培養(yǎng)次數(shù)懷疑菌血癥的成人患者：采集2~3套血培養(yǎng)標本（不同部位）嬰幼兒患者：采集兩次血培養(yǎng)標本（不同部位）除特殊情況外，在采集血培養(yǎng)后的2~3天內(nèi)，無需重復(fù)采集血培養(yǎng)可疑持續(xù)性菌血癥：如心內(nèi)膜炎、導(dǎo)管相關(guān)血流感染，間隔（1~24h）幾次取血檢測、捕捉、指導(dǎo)治療實驗室類型: 美國私立大醫(yī)院微生物實驗室

醫(yī)院病床數(shù): 800beds

微生物標本量: 600個標本/天

血培養(yǎng)標本量: 150瓶/天

血培養(yǎng)標準采樣: 3套瓶/24小時(1個需氧瓶+1個厭氧瓶=1套)

陽性結(jié)果: 10-30株需氧或兼性厭氧菌/天,2株厭氧菌/月

BacT/ALERT3D240 7臺

實驗室類型: 美國大型獨立實驗室

標本來源: 14家中型醫(yī)院和一些小診所

微生物標本量: 8000個標本/天

血培養(yǎng)標本量: 1400瓶/天

陽性結(jié)果: 75-100個陽性結(jié)果/天

BacT/ALERT3D240 30臺(5列,每列6臺)中國某三甲醫(yī)院

微生物送檢標本分布（3200床位）

（40,000標本/年）香港大學(xué)瑪麗醫(yī)院微生物科工作人員醫(yī)師4人技術(shù)員30余人文秘和工人約30人每天接受標本約800份血培養(yǎng)200~300份痰培養(yǎng)100份

………..工作制度（24小時值班制度）白天每隔半小時核對、接種新到的標本夜間則延長至1小時國內(nèi)外血培養(yǎng)頻率1000張床位醫(yī)院名稱每天血液培養(yǎng)瓶北京協(xié)和醫(yī)院60-100美國馬里蘭州某醫(yī)院200-350菌血癥病原菌種類構(gòu)成需氧瓶厭氧瓶需氧菌兼性厭氧菌厭氧菌病原菌培養(yǎng)更完整厭氧血培養(yǎng)瓶的作用不僅培養(yǎng)厭氧菌可幫助提高兼性厭氧菌的陽性率血液在需氧瓶和厭氧瓶中分配建議常規(guī)情況下，一份血培養(yǎng)應(yīng)包括：1個需氧瓶和1個厭氧瓶（1次穿刺）當(dāng)采血量不能滿足推薦的采血量時，應(yīng)首先滿足需氧瓶的需要。注意：對于僅用需氧瓶的實驗室來講，每次采血必須注入2個需氧瓶中以確保足夠量的采血量。采血時機細菌通常在寒戰(zhàn)和發(fā)燒前1小時入血，此時為采血培養(yǎng)標本進行病原培養(yǎng)的最佳時機在考慮使用抗菌藥物之前。立即采集血培養(yǎng)標本建議同時或間隔短時間內(nèi)采集2套以上血培養(yǎng)標本血培養(yǎng)的采集部位從靜脈取血不宜從靜脈導(dǎo)管或靜脈留置口取血如必須從留置導(dǎo)管內(nèi)采血，應(yīng)同時從外周靜脈采集另一個血培養(yǎng)標本，以幫助陽性結(jié)果判讀盡快送檢做血培養(yǎng)的患者多數(shù)病情危急，采血后應(yīng)立即送檢，如不能立即送檢，需室溫保存或置35。C孵箱中，切勿冷藏全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)連續(xù)振蕩孵育和檢測同時進行，每10分鐘檢測一次，可及時發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果并報告無須盲傳，減少了血培養(yǎng)污染機會2天內(nèi)可報告90%以上的陽性結(jié)果培養(yǎng)基添加多種促細菌生長因子，適合各種細菌的生長可進行需氧菌、厭氧菌的培養(yǎng)，也可進行結(jié)核菌培養(yǎng)血培養(yǎng)結(jié)果報告緊急處理和優(yōu)先原則建議在有條件的醫(yī)院，通過醫(yī)院信息系統(tǒng)，讓臨床醫(yī)生隨時掌握血培養(yǎng)檢測的進展情況，包括血培養(yǎng)已開單，但未收到血培養(yǎng)已收到24小時無細菌生長48小時無細菌生長檢測中，尚無結(jié)果有菌生長，分離培養(yǎng)和藥敏進行中陽性培養(yǎng)結(jié)果（細菌鑒定和藥敏試驗的最終結(jié)果）加強與臨床科室的聯(lián)系要主動配合、加強交流、增進了解、互相協(xié)作、必要時參加相關(guān)科室感染病例的會診，討論有關(guān)診治方面的問題，提出有效方案，尤其對檢出細菌的種類和耐藥情況作出說明，提出防止耐藥性和醫(yī)院感染的警報和措施。Case1男，98歲，入院診斷：AECOPD肺炎？發(fā)燒：39.4度，X光檢查：右肺肺炎WBC:17.8X109/L,中性粒細胞88%Case1經(jīng)驗用藥及培養(yǎng)結(jié)果亞胺培南、替考拉寧、氟康唑，用藥24h后，癥狀無改變。痰培養(yǎng)：銅綠假單胞菌（++）、鮑曼不動桿菌（+）肺泡灌洗液培養(yǎng)：銅綠假單胞菌入院3h做血培養(yǎng)：6h系統(tǒng)提示陽性，涂片結(jié)果：革蘭陰性桿菌Case1經(jīng)驗用藥及培養(yǎng)結(jié)果入院24h血培養(yǎng)初步藥敏報告：亞胺培南R頭孢他啶R

環(huán)丙沙星R派拉西林/三唑巴坦R

頭孢哌酮/舒巴坦ICase1入院24h后改變治療頭孢派酮/舒巴坦代替亞胺培南入院后48h正式鑒定和藥敏報告銅綠假單胞亞胺培南R美羅培南R頭孢他啶R派拉西林/三唑巴坦R

環(huán)丙沙星R頭孢哌酮/舒巴坦I

氨曲南S專家提示系統(tǒng):可能是產(chǎn)金屬酶的細菌，對碳青霉烯類天然耐藥，氨曲南可逃離金屬酶的水解Case148h改變治療48h改變治療：氨曲南+妥布霉素56h癥狀明顯改善48h、54h血培養(yǎng)：無菌生長，7天后痊愈出院Case1啟示經(jīng)驗性抗菌治療帶來的不良后果細菌耐藥機制的檢測，有助于合理使用抗生素快速準確的鑒定有助于醫(yī)院感染的控制陽性率的影響因素原理上，

常規(guī)致病菌只要有1個活菌落入培養(yǎng)瓶內(nèi)，都應(yīng)該可以在幾天內(nèi)被增殖到106～7（儀器報告陽性）細菌以簡單的二分裂方式無性繁殖，其突出的特點為繁殖速度極快。細菌分裂倍增的必須時間，稱為代時，細菌的代時決定于細菌的種類又受環(huán)境條件的影響，細菌代時一般為20～30分鐘，個別菌較慢，如結(jié)核桿菌代時為18～20小時，梅素螺旋體為33個小時。大腸桿菌的代時為20分鐘，以此計算，在最佳條件下8小時后，1個細胞可繁殖到200萬上（2*106），10小時后可超過10億，24小時后，細菌繁殖的數(shù)量可龐大到難以計數(shù)據(jù)和程度。但實際上，由于細菌繁殖中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，毒性產(chǎn)物的積聚及環(huán)境pH的改變，細菌絕不可能始終保持原速度無限增殖，經(jīng)過一定時間后，細菌活躍增殖的速度逐漸減慢，死亡細菌逐增、活菌率逐減。有臨床意義的分離株

BourbeauPPetal.RoutineincubationofBacT/ALERTFAandFNbloodculturebottlesformorethan3daysmaynotbenecessary.

JClinMicrobiol.2005;43:2506-2509結(jié)果表明培養(yǎng)的前三天，有臨床意義分離株的97%被檢出，培養(yǎng)前兩天的檢出率為94%。97％Update……Low-levelbacteremia(=<10CFU/ml)maybemorecommoninpediatricpatients

thanhasbeenpreviouslythoughtandhasbeenreportedinupto38%ofculture-positivechildren,aspreviouslyreviewed(20).

如前所述，低濃度菌血癥（=<10CFU/ml）占培養(yǎng)陽性的兒童患者比例已經(jīng)達到38％，并可能比以往設(shè)想的更加多見……應(yīng)重新審視厭氧瓶的作用增加采血量增加兼性厭氧菌的分離機會增加厭氧菌的分離機會提升陽性率！AnaerobicBloodCultures

UsefulintheICU?Despitetheseobservations,thereisunwillingnessinthemedicalcommunitytoalterthecurrentpracticeofobtaininganaerobicbloodcultures.Themostcompellingreasonforthisreluctanceisthatmostclinicallysignificantaerobicbacterialpathogensarefacultativeanaerobes.Continuingthepracticeofobtainingbothaerobicandanaerobicbloodcultures,therefore,ineffectdoublesthevolumeofbloodculturedandmay,thereby,increasetheisolationofthesefacultativeorganisms.

Moreover,therearesomepathogenicorganismsthatareclassifiedasfacultativeanaerobesthatgrowmorequicklyinanaerobicconditions.Thus,bloodculturesfortheseorganismsmaybepositiveearlieroronlypositiveintheanaerobicbloodculturebottle.RylandP.Byrd,Jr,MD,FCCPThomasM.Roy,MD,FCCPEastTennesseeStateUniversityJohnsonCity,TN盡管有一些醫(yī)療單位仍不情愿進行厭氧血培養(yǎng)?？墒怯植坏貌怀姓J