基因操作原理04課件

第四章

大分子的分離和分析一、E.coli質(zhì)粒DNA的分離和純化1．質(zhì)粒DNA的小量提取第一節(jié)

DNA的分離、檢測(cè)和純化1．質(zhì)粒DNA的小量提?、俨襟E性原理在堿性條件下，線狀DNA變性，質(zhì)粒DNA維持環(huán)狀，高鹽條件下復(fù)性，除質(zhì)粒DNA外，形成沉淀。②步驟細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)、時(shí)間、量細(xì)菌的收獲和裂解質(zhì)粒DNA的純化（苯酚/氯仿梯度離心）DNApurificationKit(QiaGen)二、DNA的電泳檢測(cè)主要檢測(cè)：分子量，含量及有無1.瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖從海藻中提取的一種線狀高聚物常規(guī)熔點(diǎn)低熔點(diǎn)Gellingpoint25℃20-30℃Meltingpoint65℃電壓遷移率與電壓成正比

2kb應(yīng)

5U/cm

電場(chǎng)方向單一方向負(fù)→正脈沖電場(chǎng)幾百kb以上溫度4℃-30℃，0.5%or低熔點(diǎn)4℃bufferTAETBETPE50mM(pH7.5～8.0)2.聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）優(yōu)點(diǎn):分離率高1bp,點(diǎn)樣量高10g回收的DNA純度高非變性:遷移率與序列和組成有關(guān)變性(尿素/甲醛):無關(guān)，分離探針，S1酸產(chǎn)物分析，DNA測(cè)序三、DNA片段的純化（從agarose）1.低熔點(diǎn)agarose電泳gel+5voltris65℃5minphenolextractethanol2.透析袋，電洗脫法可用于5kb3.GlassMilk(bead)3MNaI溶液，bead吸附洗滌elute4.KitQiagen公司一個(gè)典型哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含10-5gRNA，其中80-85%為rRNA(28S,18S和5S/23S,16S,5S)三種類型)，其余15～20%主要由各種類型的低分子量RNA組成（如tRNA，核內(nèi)小分子RNA等）。mRNA為總RNA的1～5%，3‘端有一個(gè)poly(A)尾，可與oligo(dT)-纖維素，吸附，親和層析分離寡脫氧胸苷酸。第二節(jié)

RNA的分離、純化和檢測(cè)電泳槽:洗凈,水沖洗,乙醇干燥3%H2O210min0.1%DEPCH2O水洗2．H2O：0.1%DEPC溶液：用DEPC水配制（注意有些藥品，不能用DEPC,如Tris）3．其它如手套，保持干凈、清潔（二）RNA酶抑制劑1．蛋白質(zhì)抑制劑人胎盤RNase抑制劑2．氧銅核糖核苷復(fù)合物100%抑制（且抑制體外翻譯）3．硅藻土，吸附RNase二、RNA的抽提1．文獻(xiàn)法2．KitGibco/TR1ZOLReagent100ml99.8USD酚+異硫氰酸胍Qiagen/RNAeasy三、純化1．蛋白質(zhì)的去除（見上）2．DNA的去除DNaseI（RNasefree）inhibitor3．Kit4．梯度離心1．檢測(cè)蛋白質(zhì)分子量2．Westernblot3．N-torminalaminoacidsequence第三節(jié)

蛋白質(zhì)的SDS第四節(jié)

分子雜交

molecularhybridization1.根據(jù)被雜交的對(duì)象分為Southern,Northern,Western,Dot,colony(plaque)2.denature變性：熱，極端pH，有機(jī)溶劑，尿素

annealing復(fù)性：互補(bǔ)單鏈重新配對(duì)恢復(fù)成雙鏈為復(fù)性

hybridization雜交：同源單鏈重新配對(duì)恢復(fù)成雙鏈為雜性4.轉(zhuǎn)移

NitrocellulosemembraneNCnylonmembrane(chargedornot)6×SSC(orSSPE)轉(zhuǎn)移buffer

毛細(xì)管電轉(zhuǎn)移真空濾紙凝膠濾膜吸水紙玻璃板重物支持物500g時(shí)間:<1kb<1hr,>15kb>18hr2.雜交·

探針處理·

溫度42℃50%甲酰胺·

時(shí)間6-8小時(shí)

探針：DNA,Oligo,隨機(jī)DNA3.洗膜2×SSC/0.5%SDS15minRT0.1×SSC/0.5%SDS1hrat雜交溫度（三）檢測(cè)

X-filmor生化

Phosphorimage（四）探針的標(biāo)記probelabeling1．均一標(biāo)記切口平移nicktraslation:E.coliDNApolyI隨機(jī)引物randomprimer:

6Ntor6～12ntklenow2．單鏈探針ssDNA模板，通用引物，合成ssDNA探針RNA探針，RNApolymerase3．末端標(biāo)記

Klenow

標(biāo)記3’端,補(bǔ)平和置換反應(yīng)

T4polymerase標(biāo)記3’端

3’-5’外物活性強(qiáng)，特別適用于3’突出末端

Kinase

標(biāo)記5’端

正反應(yīng)

32P→5’-OHNNNN→5’pNNNN

交換反應(yīng)

過量ATP使5’-P→ADPthen32P→5’

末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記3’4．寡核苷酸Kinase末端轉(zhuǎn)移酶5．標(biāo)記物放射性:32P，33P，35S非放射性:DIGoxigeninBiotin標(biāo)記dUTP(五)DIG標(biāo)記/檢測(cè)舉例1.探針標(biāo)記6Nt隨機(jī)寡核序列苷酸引物,Klenow標(biāo)記2．檢測(cè)

漂洗blocking免疫反應(yīng)labeledAnti-DiG-Ab-Ap洗滌顯色反應(yīng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)NBT-BCIP形成棕黃色沉淀BCIP：5-溴-4-氯-3’吲哚磷酸NBT:氯化硝基四氮唑藍(lán)（染料色素）CIP的底物,也稱氮藍(lán)四唑優(yōu)點(diǎn)：無污染，方便，探針可重復(fù)使用，可控制顯色反應(yīng)，保存雜交膜，易辯別真假陽(yáng)性缺點(diǎn)：靈敏度不夠，不能多次雜交，只有0.1pg可檢測(cè)單拷貝，如g人胎盤DNA中的單拷貝二、原位雜交菌落雜交和空斑雜交1.菌落生長(zhǎng)點(diǎn)種:將陽(yáng)性重組子二個(gè)平板上(有/無膜)加CK影印:菌落和空斑，絕大多數(shù)應(yīng)為重組子(白色菌落)2．DNA的釋放與固定

有多種方法①10%SDS；②0.5NNaOH/1.5NNaCl③0.5MTris1.5NNaCl④SSC⑤干燥⑥固定80℃2hr三、斑點(diǎn)雜交類似上述方法，直接將DNA樣品點(diǎn)在雜交膜上。四、Northernblot類似于Southernblot但用于檢測(cè)RNA的分子雜交技術(shù),用于分析總RNA或mRNA。1．電泳緩沖液①甲醛buf(5×)0.1mMMOPS(pH2.0)(3-(N-瑪琳代)丙磺酸)40mMNaAc5mMEDTA(pH8.0)DEPCH2O②制膠甲醇（MW30.03）通常為37%水溶液，12.3M（pH>4.0）終濃度，1×buf+2.2M甲醇2．上樣

預(yù)處理RNA（upto30g）4.5l+5×buf2.0l

甲醛3.5l甲酰胺10l65℃15minloadingbuf50%甘油，1mMEDTA(pH8.0)0.25%BPB0.255二甲苯TFF3．電泳loading之前，預(yù)電泳5min5V/cm

電泳1～2hr后，混合正負(fù)極電泳液4．轉(zhuǎn)膜·預(yù)處理①DEPCH2O洗滌去除甲醛②ifagarose>10%or厚度>0.5cmor>2.5kb

需用0.05MNaOH處理20min,部分水解RNA③

無RNaseH2O洗滌,20×SSC浸泡45min·轉(zhuǎn)移,同Southern五、Westernblot基本原理同其它blot方式,檢測(cè)蛋白質(zhì)與Southern的關(guān)鍵區(qū)別在于探針性質(zhì):抗體(一)抗體的要求1．單克隆抗體但并非都適合，由于靶蛋白已變性。2．多克隆抗體抗體為混合物，對(duì)其特異性,親和力及濃度都一無所知對(duì)由SDS/還原劑變性處理的目標(biāo)蛋白是否還能識(shí)別應(yīng)做預(yù)備實(shí)驗(yàn)(二)簡(jiǎn)要步驟1．樣品制備SDS樣品2．runningSDS3．蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移硝酸纖維素濾膜，電轉(zhuǎn)移:三夾板/隔離電極板干燥4．染色麗春紅Sor印度墨水（射啟性檢測(cè)適用）但現(xiàn)少采用，由于有prestainMWmarker5．封閉背景脫脂奶粉5%6．第一抗體與靶蛋白結(jié)合7．二級(jí)免疫反應(yīng)抗免疫球蛋白抗體或A蛋白A蛋白可與IgG的Fc片段binding木瓜蛋白酶切割I(lǐng)gGFragmentantigenbinding,Fragmentcrystalline

標(biāo)記：125I堿性磷酸酶辣根過氧化物酶偶聯(lián)8．檢測(cè)辣根（HRP,horseradishperoxidase）

與3.3-二氨基聯(lián)苯胺作用形成

棕色沉淀