微生物實(shí)驗(yàn)四

微生物實(shí)驗(yàn)四第一頁，共二十頁，2022年，8月28日【目的要求】學(xué)習(xí)并了解簡單染色法的原理，并掌握其操作方法。掌握微生物涂片、染色的基本技術(shù)和無菌操作技術(shù)。了解革蘭氏染色法的原理，并掌握其操作方法。了解革蘭氏染色法在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。學(xué)習(xí)并掌握微生物涂片、染色的基本技術(shù)和無菌操作技術(shù)。鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法。第二頁，共二十頁，2022年，8月28日【基本原理】一、細(xì)菌的涂片及簡單染色法基本原理細(xì)菌的涂片和染色是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一項(xiàng)基本技術(shù)。所謂簡單染色法是利用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法。此法操作簡便，可用以觀察微生物的形狀、大小及細(xì)胞排列狀態(tài)，是微生物技術(shù)中應(yīng)用廣泛，操作簡便的染色法。第三頁，共二十頁，2022年，8月28日【基本原理】用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。染色前必須先固定細(xì)菌，其目的有二：一是殺死細(xì)菌，使細(xì)胞質(zhì)凝固，菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時(shí)應(yīng)盡量維持細(xì)胞原有形態(tài)，防止細(xì)胞膨脹或收縮。第四頁，共二十頁，2022年，8月28日【基本原理】二、革蘭氏染色法（經(jīng)典法）基本原理革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀革蘭氏染色法（Gramstain）不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。第五頁，共二十頁，2022年，8月28日【實(shí)驗(yàn)用品】1、菌種金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌（注：大腸桿菌是革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性球狀細(xì)菌，經(jīng)過革蘭氏染色，兩者著上不同顏色，在顯微鏡下便于區(qū)別。同時(shí)，由于兩者具有不同的個(gè)體形態(tài)，在對它們的混合涂片進(jìn)行革蘭氏染色后，根據(jù)菌體顏色和形態(tài)差異，可以判斷染色是否成功。）2、儀器顯微鏡(25臺)；3、材料載玻片（每組4個(gè)），酒精燈（每組1個(gè)），接種環(huán)（每組1個(gè)），擦鏡紙，二甲苯、香柏油，吸水紙，染色缸等； 第六頁，共二十頁，2022年，8月28日【實(shí)驗(yàn)用品】4、染料草酸銨結(jié)晶紫（CrystalViolet,CV）、沙黃、呂氏堿性美藍(lán)染液。

1）草酸銨結(jié)晶紫染液的配制：

A液： 結(jié)晶紫 2g

95％乙醇20ml

B液： 草酸銨 0.8g 蒸餾水 80ml需在用前48h將A液、B液混合，裝入棕色試劑瓶內(nèi)備用。第七頁，共二十頁，2022年，8月28日【實(shí)驗(yàn)用品】2）沙黃染液的配制：A.貯存液： 沙黃 2.5g95％乙醇 100mlB.應(yīng)用液： A液 10ml蒸餾水 90m第八頁，共二十頁，2022年，8月28日【實(shí)驗(yàn)用品】

3）呂氏(Loeffler)堿性美藍(lán)染液

A液：美藍(lán)(methyleneblue)0.6g

95%酒精30ml

B液：KOH0.01g蒸餾水100ml分別配制A液和B液，配好后混合即可。第九頁，共二十頁，2022年，8月28日【方法步驟】一、細(xì)菌的涂片及簡單染色法涂片固定染色水洗干燥鏡檢清理干燥第十頁，共二十頁，2022年，8月28日【方法步驟】圖1涂片、干燥和熱固定第十一頁，共二十頁，2022年，8月28日【方法步驟】二、革蘭氏染色法（經(jīng)典法）1、涂片在潔凈無油膩的玻片滴兩小滴蒸餾水，用灼燒滅菌冷卻后的接種環(huán)挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成極薄的菌膜，兩種細(xì)菌要混合的地方。2、固定將制成的涂片自然干燥，冷卻后固定，固定時(shí)通過火焰1-2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。第十二頁，共二十頁，2022年，8月28日【方法步驟】3、染色⑴初染將玻片置于玻片擱架上，加草酸銨結(jié)晶紫染色液(加量以蓋滿菌膜為度)，染色1-2min。傾去染色液，用自來水小心地沖洗。⑵媒染滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。⑶脫色滴加95%乙醇2-3次，脫色20-25s立即水洗，以終止脫色。（此步至關(guān)重要）。⑷復(fù)染滴加0.5%沙黃，染色2-3min，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。第十三頁，共二十頁，2022年，8月28日【方法步驟】4、鏡檢干燥后，置油鏡觀察。被染成紫色者即為革蘭氏陽性菌(G)；被染成紅色者是革蘭氏陰性菌(G-)。右圖為革蘭氏染色法顯示的炭疽和金黃色葡萄球菌第十四頁，共二十頁，2022年，8月28日【方法步驟】第十五頁，共二十頁，2022年，8月28日【注意事項(xiàng)】難以嚴(yán)格規(guī)定。一般可用已知革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌作練習(xí)，以掌握脫色時(shí)間。當(dāng)要確證一個(gè)未知菌的革蘭氏反應(yīng)時(shí)，應(yīng)同時(shí)做一張已知革蘭氏陽性菌和陰性菌的混合涂片，以資對照。染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。選用對數(shù)生長期的細(xì)菌為宜。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性。第十六頁，共二十頁，2022年，8月28日【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】1．結(jié)果1）繪出油鏡下觀察的菌體圖像革蘭氏染色效果金黃色葡萄球菌大腸桿菌混合菌第十七頁，共二十頁，2022年，8月28日【注意事項(xiàng)】玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。挑菌量宜少，涂片宜薄，過厚則不易觀察。制片要完全干燥后才能用油鏡觀察。革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為是革蘭氏陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會被認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。脫色時(shí)間的長短還受涂片厚薄、脫色時(shí)玻片晃動(dòng)的快慢及乙醇用量多少等因素的影響，第十八頁，共二十頁，2022年，8月28日2）填表表1細(xì)菌形態(tài)的描述【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】第十九頁，共二十頁，2022年，8月28日【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】

2．思考題