微生物產(chǎn)食品毒素的遺傳學(xué)方法

微生物產(chǎn)食品毒素的遺傳學(xué)方法1第一頁，共二十七頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容微生物引起的食物中毒簡介微生物產(chǎn)食品毒素的分類微生物的遺傳學(xué)研究方法微生物的遺傳學(xué)研究方法在食品毒素預(yù)防和檢測中的應(yīng)用2第二頁，共二十七頁，2022年，8月28日1997年WHO指出數(shù)十億人因食物患病食源性疾病發(fā)生率5~10%5歲以下兒童腹瀉15億例死亡300萬人中國

20-40萬人/年食物中毒死亡300人2001年，衛(wèi)生部共收到全國各地發(fā)生的食物中毒事件報告706起，中毒22193人，其中因中毒導(dǎo)致死亡184人。3第三頁，共二十七頁，2022年，8月28日微生物引起的食物中毒

指人體因吃了含有有害微生物或微生物毒素的食物而引起的一切中毒性疾患。根據(jù)引起食物中毒的機(jī)理不同可分為感染型及毒素型。

感染型食物中毒：是指病原細(xì)菌污染食物，并在食物中大量繁殖，這種含有大量活菌的食物被攝入人體，會引起人體消化道的感染而造成的中毒。毒素型食物中毒：是指食物中污染某些產(chǎn)毒微生物后，在適宜的條件下，這些微生物在食物中繁殖并產(chǎn)生毒素，由于毒素的作用而引起的中毒。

在這里我要介紹的就是造成毒素型食物中毒的微生物及其遺傳學(xué)研究方法。4第四頁，共二十七頁，2022年，8月28日微生物產(chǎn)的食品毒素細(xì)菌毒素

細(xì)菌污染食品后，在適宜的溫度、水分、pH值和營養(yǎng)條件下，大量繁殖并產(chǎn)生毒素。此類毒素大多為腸毒類型，主要作用于腸壁上皮細(xì)胞，與小腸粘膜上皮細(xì)胞膜的受體結(jié)合，使細(xì)胞膜的腺苷酸環(huán)化酶活性增強(qiáng)，最終抑制腸壁上皮細(xì)胞對鈉和水分的吸收，促進(jìn)腸液與氯離子的分泌而引起腹瀉。細(xì)菌性中毒的特點：

細(xì)菌性食物中毒有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生在夏秋季節(jié)（5-10月份）發(fā)病率較高，但死亡率較低。在食品中產(chǎn)生毒素的微生物多見于細(xì)菌和霉菌。

5第五頁，共二十七頁，2022年，8月28日細(xì)菌毒素種類及產(chǎn)毒素細(xì)菌1.葡萄球菌腸毒素葡萄球菌腸毒素主要由金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌產(chǎn)生,目前已發(fā)現(xiàn)葡萄球菌腸毒素有A、B、C、D和E5種血清型，其中以A型最為多見，其毒性也最強(qiáng)，攝入1μg即可引起中毒。潛伏期1-7h,有嘔吐、惡心和腹瀉等急性胃腸炎癥狀。葡萄球菌腸毒素為可溶性蛋白質(zhì)，但不受胰蛋白酶影響。對熱較穩(wěn)定，在室溫下至少1周內(nèi)毒性不變，破壞食品中存在的腸毒素必須加熱至100℃并持續(xù)2h。在中國，葡萄球菌腸毒素主要污染乳和乳制品、含乳糕點、涼粉、米飯和甜酒釀等。6第六頁，共二十七頁，2022年，8月28日2.肉毒梭菌毒素肉毒梭菌為革蘭氏陽性厭氧菌，在厭氧條件下于罐頭、臘腸、火腿或豆、谷類等合適基質(zhì)上可產(chǎn)生肉毒梭菌毒素，簡稱肉毒毒素。肉毒毒素是有毒性成分和非毒性成分構(gòu)成的復(fù)合物。非毒性成分對毒性成分具有保護(hù)作用，使肉毒毒素在消化道中能抵抗酸和胃蛋白酶的作用，進(jìn)入小腸后，肉毒毒素受到胰蛋白酶的作用而釋放出毒性成分。

肉毒毒素是肉毒桿菌產(chǎn)生的含有高分子蛋白的神經(jīng)毒素，是目前已知在天然毒素和合成毒劑中毒性最強(qiáng)烈的生物毒素，它主要抑制神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿，引起肌肉松弛麻痹，特別是呼吸肌麻痹是致死的主要原因。中國發(fā)生的肉毒中毒絕大部分是家庭制作豆、谷類發(fā)酵食品，如臭豆腐、豆醬等。7第七頁，共二十七頁，2022年，8月28日3.米酵菌酸米酵菌酸是由椰毒假單孢菌及其酵米面亞種產(chǎn)生的致死性外毒素。與其他細(xì)菌素素不同，米酵菌酸不是蛋白質(zhì)，而是多不飽和脂肪二酸衍生物。米酵菌酸可引起酵米面、鮮銀耳、酸涼粉和玉米粉等多種食品的中毒事故，平均病死率高達(dá)41.8%。

米酵菌中毒多以胃腸刺激癥狀起病，然后累及多種器官系統(tǒng)，具有多變和異變的特點，并且在消化道粘膜、腦膜、肝腎和皮膚等均可見充血或出血點。臨床上，徹底洗胃是搶救成功的關(guān)鍵。8第八頁，共二十七頁，2022年，8月28日4.蠟樣芽孢桿菌腸毒素在蠟樣芽孢桿菌中，有部分菌株產(chǎn)生腸毒素，并有致嘔吐型和腹瀉型胃腸炎腸毒素之分。前者具有耐熱性，常存在于米飯類食物中；后者則可能存在于各種食品中。腸毒素為分子量為55000~60000的蛋白質(zhì)。蠟樣芽孢桿菌9第九頁，共二十七頁，2022年，8月28日幾種常見食品中毒性細(xì)菌比較菌種毒素及其食物中毒類型特點中毒癥狀沙門氏菌內(nèi)毒素--為類脂、多糖和Pr的復(fù)合物感染型熱抵抗力很弱，60℃下30min即殺死嘔吐、腹瀉、腹腔疼、頭疼，體溫升高，有時痙攣葡萄球菌腸毒素、溶血毒素、殺白血球毒素、凝固酶、耐熱核酸酶、溶纖維蛋白酶毒素型耐鹽性較強(qiáng)，在10-15%的NaCl培養(yǎng)基上也能生長，病性強(qiáng)，毒素的抗熱力很強(qiáng)，120℃，20min不破壞急性胃腸炎癥狀，惡心嘔吐，多次腹瀉腹痛，吐比瀉嚴(yán)重大腸桿菌內(nèi)毒素和腸毒素一般不致病，病原性大腸桿菌的菌數(shù)平均在107cfu/g才能引起急性胃腸炎急性胃腸炎，嘔吐、腹瀉，大便呈水樣便、軟便或粘液便，重癥有血便肉毒梭菌強(qiáng)烈外毒素，肉毒素是高分子單純Pr，毒性最強(qiáng)對熱的抵抗力一般，但芽孢耐熱初期惡心、嘔吐，后出現(xiàn)全身無力、頭暈,視力模糊,瞳孔放大、言語障礙,最后呼吸困難導(dǎo)致死亡蠟樣芽孢桿菌毒素型——腸毒素該菌不分解蛋白質(zhì)，食品在感官上也無明顯變化，無異味，很容易引起食物；中毒少量菌不引起中毒，但大量食入（107cfu/g）會引起中毒一種是嘔吐型中毒，第二種是腹瀉型10第十頁，共二十七頁，2022年，8月28日其他產(chǎn)毒細(xì)菌李斯特菌變形桿菌小腸結(jié)腸炎椰爾森菌產(chǎn)氣莢膜梭菌副溶血性弧菌大腸埃希菌11第十一頁，共二十七頁，2022年，8月28日真菌毒素真菌毒素又稱為霉菌毒素，是有真菌產(chǎn)生的毒性次級代謝產(chǎn)物，能引起人和動物的病理變化或生理變化。能夠產(chǎn)生毒素的真菌主要是霉菌。霉菌毒素對熱不敏感，一般烹調(diào)加熱處理不能將毒素破壞去除，霉菌毒素引起食物中毒的特點：1.發(fā)生中毒與某些食物有聯(lián)系。2.霉菌毒素中毒癥發(fā)生往往有季節(jié)性和地區(qū)性，但無感染性。3.霉菌毒素是小分子有機(jī)化合物，不是復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子,不能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，無免疫性。4.人和家畜家禽一次性攝入含有大量霉菌毒素的食物，往往會發(fā)生急性中毒，長期少量攝入會發(fā)生慢性中毒和致癌。5.霉菌毒素食物中毒易并發(fā)維生素缺乏癥，但補(bǔ)充維生素?zé)o效。12第十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日真菌毒素種類及產(chǎn)毒菌株具有產(chǎn)生真菌毒素能力的真菌稱為產(chǎn)毒真菌，目前已知涉及10多個屬，最常見的有曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬等。1.黃曲霉毒素黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的雙呋喃香豆素類代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織劃定為Ⅰ類致癌物，目前已知黃曲霉素結(jié)構(gòu)有20種以上，其中以AFB1毒性最強(qiáng)，比氰化鉀強(qiáng)10倍，毒性比砒霜大68倍，僅次于肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最強(qiáng)的，致癌作用比已知的化學(xué)致癌物都強(qiáng)。顯微鏡下的黃曲霉13第十三頁，共二十七頁，2022年，8月28日2.雜色曲霉毒素它是雜色曲霉和構(gòu)巢曲霉等產(chǎn)生的，基本結(jié)構(gòu)為一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜蒽酮。其中的雜色曲霉毒素IVa是毒性最強(qiáng)的一種，不溶于水，可以導(dǎo)致動物的肝癌腎癌、皮膚癌和肺癌，其致癌性僅次于黃曲霉毒素。

由于雜色曲霉和構(gòu)巢曲霉經(jīng)常污染糧食和食品，而且有80%以上的菌株產(chǎn)毒，所以雜色曲霉毒素在肝癌病因?qū)W研究上很重要。糙米中易污染雜色曲霉毒素，糙米經(jīng)加工成標(biāo)二米后，毒素含量可以減少90%。真菌毒素種類及產(chǎn)毒菌株14第十四頁，共二十七頁，2022年，8月28日3.赭曲霉毒素赭曲霉毒素可由多種曲霉和青霉產(chǎn)生，其中赭曲霉和鮮綠青霉是最重要的產(chǎn)生菌。在赭曲霉毒素中以O(shè)A最為多見，毒性也最強(qiáng)。OA耐熱，穩(wěn)定性好。玉米、花生、麥類、高粱、大米和咖啡豆都可能污染OA。在天然低濃度污染條件下，OA主要表現(xiàn)為很強(qiáng)的腎毒，高劑量時還有肝毒。

真菌毒素種類及產(chǎn)毒菌株15第十五頁，共二十七頁，2022年，8月28日4.展青霉素

展青霉素又稱為棒曲霉素，是由多種青霉和曲霉產(chǎn)生的內(nèi)酯類代謝產(chǎn)物，包括展青霉、圓弧青霉、棒曲霉和巨大曲霉等。在中國主要產(chǎn)毒菌為前兩種青霉。展青霉素耐熱，在酸性溶液中穩(wěn)定，而在堿性溶液中易失活。展青霉素進(jìn)入生物體后，可與許多酶的巰基相結(jié)合，使酶活性發(fā)生變化，從而產(chǎn)生毒性作用。真菌毒素種類及產(chǎn)毒菌株16第十六頁，共二十七頁，2022年，8月28日5.其他酶菌毒素黃變米毒素：黃綠青霉毒素、桔青霉毒素、島青霉毒素鐮刀菌毒素：按其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為以下三大類?即單端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮、丁烯酸內(nèi)酯。棕曲霉毒素交鏈孢霉毒素真菌毒素種類及產(chǎn)毒菌株17第十七頁，共二十七頁，2022年，8月28日

從細(xì)菌性毒素和真菌性毒素的化學(xué)成分來看，主要可以分為：蛋白質(zhì)脂類及其衍生物小分子化合物毒素物質(zhì)毒素基因反向聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)微生物食品毒素18第十八頁，共二十七頁，2022年，8月28日微生物遺傳學(xué)研究方法微生物遺傳學(xué)研究方法包括很多，主要有雜交，生化分析和數(shù)量統(tǒng)計。其中雜交是途徑；生化分析是方法；數(shù)量統(tǒng)計是工具。對產(chǎn)食品毒素的微生物進(jìn)行遺傳學(xué)上的研究可以了解微生物產(chǎn)食品毒素的機(jī)制，對微生物進(jìn)行分類，而且能更好的應(yīng)用在食品毒素預(yù)防和檢測上。19第十九頁，共二十七頁，2022年，8月28日微生物遺傳學(xué)研究方法一.遺傳學(xué)方法1.核酸分子雜交：利用DNA分子變性和復(fù)性的性質(zhì)，使來源不同的DNA（或RNA）片段，按堿基互補(bǔ)配對原則形成雜交雙鏈分子。利用序列已知的DNA或RNA探針、按照堿基互補(bǔ)的原理來檢測樣品中未知的核酸序列。雜交后通過顯影或顯色的方法，將與探針結(jié)合的核酸序列的位置或大小顯示出來。2.轉(zhuǎn)化是受體菌直接攝取供體菌游離的DNA片段并整合到受體菌的基因組中，如肺炎球菌的轉(zhuǎn)化實驗。(普遍存在)3.轉(zhuǎn)導(dǎo)是以溫和噬菌體為載體，把供體菌的部分遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移給受體菌，如噬菌體中裝配時誤將細(xì)菌DNA片段裝入噬菌體頭部內(nèi)，當(dāng)該噬菌體感染另一受體菌時，可將供體菌的DNA攜帶入受體菌。（細(xì)菌和放線菌中有這現(xiàn)象）

20第二十頁，共二十七頁，2022年，8月28日微生物遺傳學(xué)研究方法4.結(jié)合作用5.反向遺傳學(xué)二.生化分析光譜法（吸收光譜、熒光光譜、濁度分析）電化學(xué)法生物活性檢測法免疫分析法三.數(shù)量統(tǒng)計血球計數(shù)板法液體稀釋法染色計數(shù)法平板菌落計數(shù)法比例計數(shù)法21第二十一頁，共二十七頁，2022年，8月28日微生物遺傳學(xué)研究方法已報導(dǎo)有轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的細(xì)菌和其他生物與性狀表中可以看到，在微生物中有轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的種類非常廣泛；同時，可轉(zhuǎn)化的性狀也相當(dāng)廣泛，有引起形態(tài)特征變化的性狀，也有抗藥性以及產(chǎn)生抗菌素與其他代謝產(chǎn)物能力的性狀等。生物種類性狀肺炎雙球菌莢膜多糖的合成，形態(tài)變異、抗藥性、酶的合成嗜血流感桿菌莢膜多糖合成、抗藥性金黃的葡萄球菌抗青霉素變成敏感型，抗藥性放線菌抗藥性，產(chǎn)抗菌素的能力黑曲霉?fàn)I養(yǎng)缺陷型茄子出現(xiàn)新的酶22第二十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日微生物遺傳學(xué)研究方法已經(jīng)報道有轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象的細(xì)菌及其噬菌體

如溫和噬菌體P22，在鼠傷寒沙門氏菌中就是能夠進(jìn)行普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的噬菌體，它能夠?qū)⒔o體細(xì)胞的所有遺傳性狀，包括血清型、抗藥性、發(fā)酵恩呢該、毒力、運動能力等等性狀單個或幾個在染色體上呈緊密連鎖的基因的性狀同時轉(zhuǎn)導(dǎo)給受體細(xì)胞。微生物轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體炭疽芽孢桿菌CP-51蠟樣芽孢桿菌CP-51，CP-53大腸桿菌P1，363,04-CF,肺炎克氏桿菌P1傷寒桿菌P22鼠傷寒沙門氏菌P22，ES1823第二十三頁，共二十七頁，2022年，8月28日微生物產(chǎn)食品毒素的遺傳學(xué)研究方法當(dāng)已知微生物的毒素為蛋白質(zhì)時，我們可以采用回溯法來研究微生物的毒素基因。即：當(dāng)已知微生物的毒素為酯類、小分子化合物時，我們可以采用這種方法來研究微生物的毒素基因。相應(yīng)的氨基酸對應(yīng)的密碼子對應(yīng)的毒素基因蛋白質(zhì)類毒素24第二十四頁，共二十七頁，2022年，8月28日微生物遺傳學(xué)研究方法在食品檢測上的應(yīng)用檢測方法原理優(yōu)點不足酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)（ELISA)利用酶標(biāo)記物同抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用相結(jié)合，當(dāng)偶聯(lián)物與故鄉(xiāng)載體上的抗原或抗體反應(yīng)而呈顏色。敏感、快速、簡單假陽性或假陰性影響檢測結(jié)果聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（