dna損傷修復與抗腫瘤藥物研究課件

馮冰虹教授DNA損傷修復與抗腫瘤藥物研究2基因突變（genemutation）:

在生物進化過程中，由于生物體內外環(huán)境多種因素的影響，使遺傳物質的結構改變而引起遺傳信息的改變，均可稱為突變。

從分子水平來看，突變主要表現為DNA分子上堿基的改變。

在復制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷（DNAdamage）。突變的意義3（一）突變是進化、分化的分子基礎。（二）只有基因型改變，而無可察覺表型改變的

突變（基因多態(tài)性：用于描述個體之間的

基因型差別現象）。（三）致死性的突變（利用此特性消滅有害病原

體）。（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎。一、引起DNA損傷的因素5*紫外線照射*電離輻射自發(fā)突變：

頻率：10-9*5-溴尿嘧啶(5-BU)*羥胺*亞硝酸鹽*氮芥類物理生物化學誘變因素病毒等DNA損傷的后果信號傳導異常長時辰效應老化腫瘤疾病DNA修復機制短期效應異常增生和代謝生理功能紊亂細胞死亡細胞增殖減少基因表達異?；蚪M不穩(wěn)定6（一）DNA的自發(fā)性損傷71、DNA的復制錯誤2、DNA的修復合成

修復系統將DNA損傷部位的一段DNA切除，再以互補鏈為模板重新合成DNA，又稱DNA非程序合成。3、堿基的自發(fā)突變脫氨基:A、G、C環(huán)外氨基丟失堿基丟失:無堿基位點(AP部位)4、正常代謝產物對DNA的損傷氧自由基造成DNA鏈斷裂92、電離輻射引起DNA損傷（1）導致堿基變化

主要由·OH自由基引起，包括DNA鏈上堿基氧化修飾、過氧化物形成、堿基環(huán)的破壞和脫落等。（2）導致脫氧核糖變化

脫氧核糖上每個碳原子和羥基上氫都能與·OH反應,導致脫氧核糖分解，最終引起DNA鏈斷裂（3）導致DNA鏈斷裂

可使脫氧核糖破壞或磷酸二酯鍵斷開而導致DNA鏈斷裂。有單鏈斷裂、雙鏈斷裂等不同形式。（4）引起DNA鏈交聯DNA-DNA交聯、DNA-蛋白質交聯。是細胞受電離輻射后在顯微鏡下看到的染色體畸變的分子基礎103、烷化劑引起DNA損傷（1）導致堿基烷基化G的N7和A的N3最容易烷基化，G的N7被烷基化后改與T配對，G-C→A-T（2）導致堿基脫落G烷基化后的糖苷鍵不穩(wěn)定，易脫落形成DNA上無堿基位點，復制時可插入任何核苷酸，使序列改變。（3）導致DNA鏈斷裂

磷酸二酯鍵上的O易烷基化，形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，糖與磷酸間發(fā)生水解，DNA鏈斷裂。（4）引起DNA鏈交聯單功能基烷化劑：甲基甲烷碘酸雙功能基烷化劑：DNA鏈內、鏈間、以及與蛋白質的交聯氮芥、硫芥；環(huán)磷酰胺；二乙基亞硝酸114、堿基類似物、修飾劑引起堿基對的改變（1）堿基類似物用作促突變劑或抗癌藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）、5-溴尿嘧啶（5-BU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）。（2）某些化學物質能專一修飾DNA鏈上堿基亞硝酸鹽：使C脫氨變成U，經復制使G-C→A-T羥胺：使T脫甲基變成C，結果A-T→G-C黃曲霉素B：專一攻擊DNA上堿基，導致序列變化這些均為誘發(fā)突變的化學誘變劑或致癌劑1.堿基和糖基破壞●損傷因素酸、熱去嘌呤作用、堿基修飾劑、自由基、活性氧、紫外線●損傷類型堿基丟失/插入、堿基置換、DNA片段缺失/插入132.錯配●損傷因素

堿基類似物、堿基修飾劑、自發(fā)脫氨基●常見錯配類型U→T143.DNA鏈斷裂

●損傷因素

電離輻射、化學物質誘導

●損傷類型單鏈斷裂、雙鏈斷裂（最嚴重損傷，不能原位修復，易致畸)15DNA交聯示意圖17第二節(jié)DNA損傷的修復的機制18常見的DNA損傷及其修復機制

DNA損傷因素

DNA損傷類型修復機制X射線、氧自由基、烷化劑自發(fā)脫堿基單鏈斷裂、無堿基位點、氧化性堿基（如8-氧鳥嘌呤）脲嘧啶堿基切除修復紫外線和多環(huán)芳烴環(huán)丁烷嘧啶二聚體等大的紫外線光產物和穩(wěn)定的多環(huán)芳烴化合物等大分子DNA加合物核苷酸切除修復抗癌藥（如順鉑和絲裂霉素）雙鏈斷裂和鏈間交聯雙鏈斷裂修復（同源重組修復和末端連接）復制錯誤和烷化劑堿基錯配和缺失（插入）錯配修復19二、DNA損傷的修復的機制光復活酶與DNA鏈上嘧啶二聚體部位結合↓受波長為260-380nm的近紫外線作用激活使二聚體解聚↓酶從DNA鏈上解離，DNA恢復正常結構

（一）回復修復●酶學光復活21光修復酶(photolyase)

UV22232023/2/62525（二）切除修復

●定義

在多種酶的作用下，先將損傷區(qū)域切除，然后利用互補鏈為模板，合成一段正確配對的堿基順序來修補●切除過程

●切除方式堿基切除修復、核苷酸切除修復識別并切除→修復合成并連接26.糖甘水解酶識別改變了的堿基，把堿基從N-β-糖苷鍵處切下來，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點，統稱為AP位點。29由AP磷酸內切酶將受損核甘酸的糖苷-磷酸鍵切開5‘3‘30DNA連接酶連接利用DNA聚合酶I在切除損傷部位，補上核苷酸312023/2/63232●

核苷酸切除被切除的不是單個堿基，而是一段寡核苷酸。是細胞內更為重要的一種修復方式

●切除修復的特點是DNA修復的一種普遍形式332.2核苷酸切除修復（Nucleotideexcisionrepair,NER）

是機體正常細胞針對DNA鏈上較大損傷的修復過程，它由多種DNA修復酶組成。

342.2核苷酸切除修復（Nucleotideexcisionrepair,NER）

損傷發(fā)生后，首先由DNA切割酶(excinuclease)在己損傷的核苷酸5’和3’位分別切開磷酸糖苷鍵，產生一個由12～13個核苷酸(原核生物)或27～29個核苷酸(人類或其他高等真核生物)的小片段，移去小片段后由DNA聚合酶Ⅰ(原核)或ε（真核)合成新的片段，并由DNA連接酶完成修復中的最后一道工序。35識別損傷部位損傷的兩邊切除幾個核苷酸DNA聚合酶以母鏈為模板復制合成新子鏈DNA連接酶將切口補平36（三）重組修復●定義重組酶系將未受損傷的DNA

片段移到損傷部位，提供正確的模板，進行修復●分類

●同源性重組兩段雙鏈DNA同源性大于200bp，大腸桿菌及酵母中RecA蛋白、人細胞中Rad51是關鍵●非同源性重組同源性低，DNA雙鏈斷裂的主要修復方式，關鍵分子是DNA-PK及XRCC4，非精確修復372023/2/63838復制中出現損傷重組修復DNA聚合酶填補缺損392023/2/64040（四）錯配修復（mismatchrepair，MMR）

DNA錯配修復是細胞復制后的一種修復機制,具有維持DNA復制保真度,控制基因變異的作用。錯配修復實際上是一種特殊的核苷酸切除修復，它專門用來修復在DNA復制中出現的新合成DNA鏈上的錯配的堿基。但如何避免將DNA鏈上正確的堿基切除呢？這就需要將oldstrand和newstrand區(qū)分開來。41原核生物利用甲基化區(qū)分oldstrand和newstrand，因此原核細胞中的錯配修復也稱甲基化指導的錯配修復（methyl-directedmismatchrepair）。42錯配修復系統識別母鏈靠Dam甲基化酶（Dammethylase），它能使位于5’GATC序列中A的N6位甲基化。一旦復制叉通過復制起始位點，母鏈就會在開始DNA合成前的一小點時間（幾秒鐘至幾分鐘）內被甲基化。剛合成的DNA新鏈上的GATC序列還沒有來得及甲基化，而作為模板的oldstrand早已被甲基化了，利用這種差別區(qū)分oldstrand和newstrand。

43此后，一旦發(fā)現錯配堿基，錯配修復系統就會根據“保存母鏈，修正子鏈”的原則，找出錯誤堿基所在的DNA鏈即將未甲基化的鏈切除，并以甲基化的鏈為模板進行修復合成。GATC中A甲基化與否常用來區(qū)別新合成的鏈（未甲基化）和模板鏈（甲基化）。這一區(qū)別很重要44錯配修復（mismatchrepair）●Dam甲基化酶使母鏈位于5’GATC序列中腺苷酸甲基化●甲基化緊隨在DNA復制之后進行●根據復制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子鏈上的錯配堿基通過3個蛋白質（MutS、MutH和MutL）校正45

根據母鏈甲基化原則找出錯配堿基的示意圖1.MutS發(fā)現錯配堿基2.在水解ATP的作用下，MutS，MutL與堿基錯配點的DNA雙鏈結合3.MutS-MutL在DNA雙鏈上移動，發(fā)現甲基化DNA后由MutH切開非甲基化的子鏈46

甲基化指導的錯配修復示意圖錯配堿基位于切口3’下游端，錯配堿基位于切口5’上游端，47（五）SOS修復

●

定義

DNA損傷時應急產生的修復作用，解除修復系統抑制，使其產物(多種修復蛋白)參與修復48SOS修復中LexA-RecA操縱子的作用機理49當細菌DNA遭到破壞時，細菌細胞內會啟動一個被稱為SOS的誘導型DNA修復系統。在正常情況下，DNA損傷的修復基因的操縱子被LexA蛋白所阻遏。SOS修復系統受到LexA阻遏蛋白的抑制，平時該蛋白表達水平很低。SOS體系的誘導表達過程其實就是LexA阻遏蛋白從這個基因的上游調控區(qū)移開的過程。阻遏蛋白LexA的降解與細菌中的SOS應答50當有紫外線照射時，細菌體內的RecA蛋白水解酶被激活，催化LexA阻遏蛋白裂解失活，從而導致與DNA損傷修復有關的基因表達。RecA蛋白：是SOS反應的最初的發(fā)動因子。在單鏈DNA和ATP存在時，RecA蛋白被激活，表現出水解酶活性，分解LexA阻遏物。51表達RecA蛋白與這些缺口處單鏈DNA相結合，被激活成蛋白酶。具有蛋白酶活性的RecA蛋白將LexA蛋白切割成沒有阻遏作用的和具有與操縱區(qū)DNA結合活性的兩個片段，導致SOS體系的高效表達，使DNA得以修復。52SOS反應

SOS基因紫外線激活RecALexA阻遏蛋白

與DNA損傷修復有關的酶和蛋白質基因表達LexA阻遏蛋白操縱序列DNA53

當修復完成后，活化信號消失，RecA蛋白回復到非蛋白水解酶的形式，LexA蛋白開始逐步積累，并重新建立起阻遏。RecA蛋白的合成停止，DNA恢復復制，RecA蛋白被稀釋到原來的本底水平。54三、DNA修復的細胞周期檢查點控制

真核生物細胞DNA受到損傷時細胞除了誘導修復基因的轉錄外，還可暫時阻斷細胞周期，防止受損DNA繼續(xù)復制，如無法修復，則可誘導細胞進入凋亡。這些都是細胞通過細胞周期檢查點控制（checkpointcontrol，又稱關卡控制）對DNA損傷的應答反應。55酵母細胞的細胞周期檢查點控制機制DNA損傷在S期DNA損傷在G1

和G2

期G1SG2MPOL2RFC5DPB11RAD9RAD17RAD24MEC3MEC1,TEL1RAD5356哺乳類動物的細胞周期檢查點控制機制DNA損傷P21Gadd45BaxP53CDK/cyclinGadd45Gadd45-PCNABlockingcellcycleExcisionrepairingCellapoptosis57四、DNA損傷應答的研究進展

（一）乙酰轉移酶Tip60在DNA損傷應答中作用的研究進展

Tip60(Tat—interactiveprotein)是進化上極為保守的乙酰轉移酶，它在細胞周期阻滯、凋亡、DNA損傷修復等眾多生理學過程中都發(fā)揮著重要的作用。

作為許多轉錄因子的共調節(jié)因子，Tip60既可以激活也可以抑制特定基因的轉錄。當發(fā)生DNA損傷時，它被招募到損傷位點，參與DNA損傷應答的感受、信號轉導和修復過程中。

除此之外，Tip60還與許多病理過程有關，尤其是在腫瘤發(fā)生中起著關鍵作用。58

Tip60可以p53依賴和不依賴兩種方式參與DNA損傷應答：59（二）調控DNA損傷修復基因的miRNA606162第三節(jié)DNA損傷和修復的基因63一、甲基化損傷修復相關基因

甲基轉移酶（MGMT）把O6-甲基鳥嘌呤的甲基轉移到自身的半胱氨酸殘基上，修復甲基化的DNA。MGMT突變可作為甲基化損傷的基因型標記物。64二、切除修復相關的酶和基因尿嘧啶糖基化酶為主要的始動因素，可作為DNA損傷的生物標記物。大腸桿菌Uvr基因家族、人ecrr基因和切除修復基因等65三、錯配修復相關基因MSH2、MLH1等蛋白參與錯配修復，而錯配修復的缺陷往往是癌變的第一步。錯配修復基因：Muthls系統、人類的hmsh2/3、hpmsl1/2、Mutsa、msh6。錯配修復基因的微衛(wèi)星序列的不穩(wěn)定性（microsatelliteinstability，MI）66四、DNA聚合酶β

DNA聚合酶β參與輻射損傷和化學損傷的修復，并對細胞的生長具有調節(jié)作用。

DNA聚合酶β

的突變可導致堿基切除修復功能的缺陷。67五、DNA加合物

英文名稱：DNAadduct定義：DNA分子與化學誘變劑間反應形成的一種共價

結合的產物。這種結合激活了DNA的修復過程。

如果這種修復不是發(fā)生在DNA復制前，會導致核

苷酸的替代、缺失和染色體的重排。

DNA加合物可作為DNA損傷的暴露標記物和效應標記物，其去除的速度也可作為DNA修復功能的生物標記物。68DNA損傷和修復的生物學意義避免基因組的不穩(wěn)定性、癌癥和細胞死亡是至關重要的。DNA修復途徑可以識別和修復特異的DNA損傷，保證生物物種的遺傳穩(wěn)定性。69第四節(jié)與DNA修復有關的人類遺傳疾病著色性干皮病(Xerodermapigmentosum)

布倫氏癥候群(Bloom’ssyndrome)

遺傳性大腸癌(Hereditarynonpolyposiscoloncancer；HNPCC)

7071著色性干皮病

(Xerodermapigmentosum)

是一種隱性遺傳性疾病，有些呈性聯遺傳。因核酸內切酶異常造成DNA修復障礙所致。臨床以光暴露部位色素增加和角化及癌變?yōu)樘卣鳌?/p>

1.幼年發(fā)病，常有家族發(fā)病史。2.面部等暴露部位出現紅斑、褐色斑點及斑片，伴毛細血管擴張，間有色素脫失斑和萎縮或疤痕。皮膚干燥。數年內發(fā)生基底細胞癌、鱗癌及惡性黑素瘤。3.皮膚和眼對日光敏感。4.病情隨年齡逐漸加重，多數患者于20歲前因惡性腫瘤而死亡。5.組織病理晚期出現表皮非典型性增生、日光角化及鱗癌和基底細胞癌等惡性腫瘤。72著色性干皮病患兒臉部特征73著色性干皮病背部,著色性干皮病組織切片74著色性干皮病的并發(fā)癥75著色性干皮病的治