GMP質(zhì)量體系銅綠假單胞菌檢查法

目的：建立銅綠假單胞菌檢查法的標準操作程序，規(guī)范銅綠假單胞菌檢查法的操作。范圍：適用于銅綠假單胞菌檢查法。職責：檢驗科主管、檢驗員。規(guī)程：1簡述銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa），習稱綠膿桿菌，為假單胞菌屬菌種，廣泛分布在土壤，水及空氣，人和動物的皮膚、腸道、呼吸道均有存在，故可通過環(huán)境和生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)污染藥品。本菌是常見的化膿性感染菌，在燒傷，眼科及其他外科疾患中常引起繼發(fā)感染，由于本菌對許多抗菌藥物具有天然的耐藥性，增加了治療的難度，國內(nèi)外藥典均將銅綠假單胞菌檢查列為檢查項目之一。銅綠假單胞菌按增菌、分離、純培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢及生化試驗等步驟進行檢驗。儀器、設(shè)備和用具（見大腸桿菌檢驗法2）3試液、指示液0.9%無菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液［附錄3.1，3.3］1%鹽酸二甲基對苯二胺試液［附錄2.1］鹽酸試液［附錄2.12］氯仿 ［附錄1.57］4培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基［附錄5.1］4.2膽鹽乳糖(BL)培養(yǎng)基［附錄5.6］4.3營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基［附錄5.2］4.4溴代十六烷基三甲胺［附錄5.14］4.5綠膿菌素測定用培養(yǎng)基(PDP瓊脂)［附錄5.26］4.6明膠培養(yǎng)基［附錄5.27］4.7硝酸鹽胨水培養(yǎng)基［附錄5.28］5對照用菌液銅綠假單胞菌〔CMCC(B)10104〕營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi),于36±1℃培養(yǎng)18～24h后，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1:106，使對照菌加入量含菌50～100個(一般用量為0.1ml)，菌數(shù)在做陽性對照實驗的同時用營養(yǎng)瓊脂平板涂布經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)確定。6操作方法6.1供試品的取樣量［見細菌、霉菌(酵母菌)計數(shù)5.3］6.2供試液的制備，［見細菌、莓菌(酵母菌)計數(shù)。6.2］大腸桿菌檢查法。6.3增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3瓶，每瓶100ml，2瓶分別加入1：10供試液10ml(相當于供試品1g或1ml)，其中一瓶加入對照菌50～100個作為陽性對照。第3瓶加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照。于36±1℃培養(yǎng)18～24h(必要時可延至48h)。陽性對照應(yīng)生長良好，陰性對照菌應(yīng)無菌生長。6.4分離培養(yǎng)輕輕搖動上述增菌培養(yǎng)液，以接種取1～2環(huán)培養(yǎng)液(如有菌膜應(yīng)挑取之)，劃線接種于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板，于36±1℃培養(yǎng)18～24h。銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)基平板上的典型菌落為扁平、圓形或無定形、邊緣不齊、光滑濕潤、呈灰白色,周邊略呈擴散現(xiàn)象，在菌落相鄰處常有融合現(xiàn)象。菌落周圍常有水溶性藍綠色素擴散，使培養(yǎng)基顯藍綠色，但亦有不產(chǎn)色素的菌株。菌落還有粗糙型和粘液型等，應(yīng)注意挑選。當陽性對照平板呈典型菌落生長時，供試品平板無菌落生長或無疑似菌落生長，可報告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞菌。制備供試液，以消除供試品抑菌成分的影響。6.5純培養(yǎng)供試品分離平板生長6.4所述典型菌落或呈疑似菌落時，以接種針輕輕接觸單個菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑取2～3個疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)，作以下檢查。6.6革蘭氏染色鏡檢6.6.1革蘭氏染色(見大腸桿菌檢驗法6.6.1)6.2.2鏡檢銅綠假單胞菌為革蘭氏陰性，無芽孢桿菌，單個，成對或成短鏈排列。6.7生化試驗6.7.1氧化酶試驗取一小塊白色潔凈的濾紙置平皿內(nèi)，以無菌玻璃棒挑取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，涂在濾紙上，隨即滴加1滴新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30s內(nèi)，紙片上的培養(yǎng)物出現(xiàn)粉紅色，逐漸變?yōu)樽霞t色，即為氧化酶試驗陽性反應(yīng)。若培養(yǎng)物不變色或僅顯粉色為陰性反應(yīng)。本試驗應(yīng)注意(1)試驗菌落(苔)必須新鮮，陳舊培養(yǎng)物反應(yīng)不可靠。(2)試驗避免與鐵、鎳等金屬接觸，不可用普通接種針(環(huán))(白金材料除外)挑取菌落(苔)否則易出現(xiàn)假陽性。宜用玻璃棒或木棒。(3)試劑宜新鮮配制，放置過久，二鹽酸二甲基對苯二胺氧化變色不可用。(4)反應(yīng)需在有氧條件進行，勿滴加試劑過多，以免浸泡培養(yǎng)物使之與空氣隔絕，造成假陰性反應(yīng)。6.7.2綠膿菌素試驗取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于綠膿菌素測定用培養(yǎng)基(PDP)斜面上，36±1℃培養(yǎng)24h后，觀察斜面有無色素，如有色素，在試管內(nèi)加氯仿3～5ml，以無菌玻棒攪拌碎培養(yǎng)基并充分振搖。使培養(yǎng)物中的色素完全萃取在氯仿液內(nèi)。靜置片劑，待氯仿分層，用吸管將氯仿移至另一試管中，加入鹽酸試液(1mol/L)約1ml，振搖后靜置片刻，如在鹽酸液層內(nèi)出現(xiàn)粉紅色，即為陽性反應(yīng)，無粉紅色出現(xiàn)為陰性反應(yīng)。如培養(yǎng)基斜面無色素產(chǎn)生，應(yīng)于室溫培養(yǎng)1～2天再按上法試驗。凡經(jīng)再次檢驗，綠膿菌素試驗仍陰性者，應(yīng)繼續(xù)以下試驗。6.7.3硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗以接種沾取少許營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置36±1℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。如果在培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體產(chǎn)生，即為陽性反應(yīng)，表明該培養(yǎng)物能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣。小倒管內(nèi)無氣泡者為陰性反應(yīng)。6.7.441℃生長試驗以接種環(huán)沾取少許營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物于0.9%無菌氯化鈉液中，制成菌懸液。然后將菌懸液劃線接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，立即置41±1℃的恒溫水浴箱內(nèi)，務(wù)使整個斜面浸沒在水浴中，培養(yǎng)24～48h，斜面如有菌苔生長者為陽性反應(yīng)，無菌苔生長為陰性反應(yīng)。6.7.5明膠液化試驗以接種針沾取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，穿刺接種于明膠培養(yǎng)基中，穿刺深度應(yīng)接近培養(yǎng)基的底部，于36±1℃培養(yǎng)24h。取出入冰箱內(nèi)10～30min。如培養(yǎng)基呈溶液狀，即為明膠液化試驗陽性反應(yīng)；如明膠呈凝固狀，為陰性反應(yīng)。本試驗應(yīng)注意(1)本試驗接種前，培養(yǎng)基應(yīng)為固態(tài)，否則需將培養(yǎng)基置冰箱內(nèi)使之凝固后，再穿刺接種。(2)試驗應(yīng)同時設(shè)未接種細菌的陰性對照管，與試驗管同時培養(yǎng)并觀察結(jié)果。7結(jié)果報告7.1供試品培養(yǎng)物經(jīng)證實為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶試驗及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌。7.2供試品培養(yǎng)物氧化酶試驗陽性，鏡檢為革蘭氏陰性桿菌的培養(yǎng)物，綠菌素試驗陰性時，其硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗、41℃生長試驗及明膠液化試驗皆為陽性時，亦報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌。7.3凡與7.1與7.2結(jié)果不符時報告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞菌。8注意事項8.1銅綠假單胞菌污染藥品后，因生產(chǎn)工藝和藥物的影響，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形態(tài)可產(chǎn)生非典型形態(tài)。為防止漏檢，在挑取疑似菌落時，宜取2～3個以上菌落，分別進行檢驗，以提高銅綠假單胞菌的檢出率。8.2綠膿菌素是銅綠假單胞菌鑒定的重要特征，但色素的產(chǎn)生受許多因素的影響，除菌株差異及變異外，培養(yǎng)條件是重要因素