探討p75NTR作為預測口腔鱗狀細胞癌愈后指標的可能性,細胞生物學論文

探討p75NTR作為預測口腔鱗狀細胞癌愈后指標的可能性,細胞生物學論文腫瘤干細胞〔cancerstemcells，CSCs〕是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化及較強增殖能力的少量干細胞樣癌細胞亞群，是腫瘤起源、生長、轉移與復發(fā)的根本源頭所在。近年來，尋找靶向殺死腫瘤干細胞的抗癌策略已成為研究的熱門。華而不實，選擇何種細胞外表標志物來證實舌癌中腫瘤干細胞的存在并完成對腫瘤干細胞的提取和鑒別是首要亟待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體〔p75neu-rotrophinreceptor，p75NTR〕的表示出與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關，并已證實其在全身多種腫瘤中能夠作為一種腫瘤干細胞的外表標志物。本實驗采用p75NTR對舌鱗狀細胞癌細胞系Tca-8113及Cal-27進行標記、檢測、分選，并對分選后的p75NTR陽性細胞進行生物學特性研究，討論p75NTR作為腫瘤干細胞標志物和預測口腔鱗狀細胞癌愈后指標的可能性，為深切進入研究舌鱗狀細胞癌的發(fā)病機理和尋找新的治療靶點提供線索。1、材料和方式方法1.1材料Tca-8113、Cal-27細胞株來源于口腔舌鱗狀細胞癌，由上海交通大學附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室惠贈。Tca-8113細胞株用含10%FBS〔杭州四季青生物工程材料研究所〕的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。Cal-27細胞株用含10%FBS〔GIBCO公司，美國〕的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。PE標記的鼠抗人p75NTR抗體及PE標記的小鼠骨髓瘤蛋白IgG1,抗體均購自美國BD公司。1.2流式細胞儀檢測p75NTR陽性細胞的表示出。將生長狀況良好并處于對數(shù)生長期的Tca-8113細胞制備成單細胞懸液，并且調(diào)整細胞密度為1.0106個mL-1。實驗分為2組，實驗組參加100LPE標記小鼠抗人p75NTR抗體，對照組參加等量的PE標記小鼠骨髓瘤蛋白IgG1,。放入冰里置于震蕩箱中蔽光孵育半小時，1000rmin-1離心5min，吸棄上清后BufferIlmL沖洗吹打〔反復沖洗、離心2次〕，重懸于400LPBS中。將參加等量PE標記小鼠骨髓瘤蛋白IgG1,的對照組先上機調(diào)節(jié)機器參數(shù)，然后取實驗組上機檢測細胞熒光值，分析p75NTR陽性細胞的百分含量，重復3次取平均值。同法處理Cal-27細胞。1.3p75NTR陽性細胞生物學特性檢測1.3.1以p75NTR為標記分選陽性細胞作為實驗組將生長狀況良好并處于對數(shù)生長期的較大數(shù)量的2種舌鱗狀細胞癌細胞〔約1.0108個mL-1〕如上法處理后上機進行高速分選，獲得p75NTR陽性細胞，作為實驗組。為了保證分選后富集的p75NTR陽性細胞的純度，分選時選取強陽性區(qū)域。重復上機一次，以避免標記物丟失造成的陽性率偏低。并取適量分選后的細胞上機檢測p75NTR陽性細胞的純度。1.3.2對照組處理將同等條件培養(yǎng)的2種舌鱗狀細胞癌細胞系細胞制備成單細胞懸液，參加PE標記小鼠抗人p75NTR抗體，放入冰里置于震蕩箱中蔽光孵育半小時，再放入離心機離心5min〔1000rmin-1〕，棄上清后BufferIlmL沖洗吹打〔反復沖洗、離心2次〕，作為對照組備用。1.3.3單克隆培養(yǎng)取對數(shù)生長期的2組細胞于超凈臺中常規(guī)消化制成單細胞懸液后，用有限稀釋法接種于96孔板中。5%CO2、37℃飽和溫度環(huán)境培養(yǎng)觀察細胞貼壁情況，記錄僅有一個細胞的孔，并做標記。2周后統(tǒng)計單克隆構成率。收集p75NTR陽性細胞構成的單克隆細胞，培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，再培養(yǎng)2周后進行p75NTR的流式細胞檢測。1.3.4四甲基偶氮唑鹽比色法[(3-(4,5)-demethylthiazo(z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide，MTT]實驗收集2組細胞，分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板中〔每孔約4103個細胞〕〔周邊空不加〕，再各參加200L培養(yǎng)液〔周邊空不加，B3孔只參加PBS作為對照〕。培養(yǎng)24h后，換液，B3孔換200LPBS。每孔參加20LMTT溶液，培養(yǎng)4h后吸出上清液，參加150L二甲基亞砜〔dimethylsulfoxide，DMSO〕，置于搖床上低速震蕩10min。以B3孔為調(diào)零孔，上酶聯(lián)免疫檢測儀，以490nm吸光度值量化活細胞數(shù)，每次檢測一豎列的6個平行孔，每組所得數(shù)據(jù)取平均值，連續(xù)檢測7d。以生長時間為橫坐標，以光密度〔op-ticaldensity，OD〕值為縱坐標，繪制細胞的生長曲線。1.3.5劃痕實驗將2組細胞以每孔1105個的密度接種于六孔板中，待細胞生長到80%~90%時，無菌條件下更換為無血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12h后，于超凈臺中用200L槍頭在每個孔的中間劃一條豎直的線，PBS沖洗3遍。每孔參加2mL完全培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。之后天天換液，拍照，連續(xù)8d。1.4統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。各組間的比擬采用2檢驗進行分析，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2、結果2.1流式細胞儀檢測p75NTR陽性細胞的表示出舌鱗狀細胞癌細胞株Tca-8113、Cal-27細胞中，p75NTR陽性細胞的比例分別為3.1%和1.9%。2.2流式細胞分選及純度檢測分選后p75NTR陽性細胞的比例分別為98.1%〔Tca-8113〕和97.4%〔Cal-27〕。這表示清楚目的細胞陽性率比擬高。2.3單克隆培養(yǎng)2組單克隆構成能力的比擬見表1。從表1可見，只要小部分細胞能持續(xù)分裂增殖。實驗組的單克隆構成能力高于對照組〔Tca-8113細胞，P=0.024；Cal-27細胞，P=0.009〕。這表示清楚p75NTR陽性細胞具有自我更新和分化能力。單克隆細胞再培養(yǎng)2周后，Tca-8113的p75NTR陽性細胞率降為14.5%，Cal-27的p75NTR陽性細胞率降為5.8%。2.4MTT實驗細胞生長曲線〔圖12〕表示清楚：2組細胞第1天生長情況無明顯差異，從第3天之后實驗組細胞較之對照組細胞體外增殖能力明顯加強，第5天及第7天時愈加顯著〔P0.05〕。2.5劃痕實驗劃痕后7d，實驗組較對照組具有明顯的愈合能力〔圖34〕。Tca-8113實驗組到第8天已經(jīng)基本被細胞長滿，而對照組卻仍有空白區(qū)域〔圖5〕，Cal-27實驗組到第5天已經(jīng)基本長滿劃痕區(qū)域，完全長滿需要7d〔圖6〕。這講明實驗組具有明顯的侵襲遷移能力。3、討論腫瘤干細胞是腫瘤起源、生長、轉移與復發(fā)的根本源頭所在。近年來，通過對其生物學特性的研究，尋找靶向殺死腫瘤干細胞的抗癌策略成為研究的熱門。p75NTR是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子的低親和力受體，可通過不同的信號傳導通路誘導細胞發(fā)生增殖、分化、遷移、凋亡等生物學行為。近年來，研究發(fā)現(xiàn)p75NTR的表示出與胃癌、視網(wǎng)膜成神經(jīng)細胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關，并已證實其在全身多種腫瘤中可作為一種腫瘤干細胞的外表標志物。本實驗檢測發(fā)現(xiàn)p75NTR在舌鱗狀細胞癌細胞系Tca-8113及Cal-27中都有陽性表示出，且其陽性率分別為3.1％和1.9％。這與以往報道中腫瘤干細胞數(shù)量相當。腫瘤細胞的克隆構成能力與其致瘤能力呈正相關，并且只要腫瘤干細胞具有單克隆構成能力和強致瘤性。本研究單克隆培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)兩個細胞株的p75NTR陽性細胞的體外單克隆構成能力相對于未分選的細胞均顯著加強，符合其是具有自我更新能力的腫瘤干細胞的理論。同時，本實驗利用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)單克隆4周后的p75NTR陽性細胞的p75NTR陽性率明顯下降，其分化產(chǎn)生了大量p75NTR陰性細胞，該結果講明p75NTR陽性細胞具有較強的克隆構成能力并具有一定的分化潛能。本研究用MTT法對舌鱗狀細胞癌細胞株Tca-8113和Cal-27中的p75NTR陽性細胞及未分選細胞的體外增殖能力進行測定，發(fā)現(xiàn)p75NTR陽性細胞的生長速度明顯快于未分選的細胞，這也表示清楚p75NTR陽性細胞具有較強的增殖能力，符合其作為腫瘤干細胞的特性。侵襲轉移是惡性腫瘤最重要的生物學行為，是導致手術、放療、化療失敗和患者死亡的主要原因。劃痕實驗證明p75NTR陽性細胞具有更強的遷移能力。由于2種細胞的生長速度差異不同較大，所以在劃痕實驗中沒有做同期的橫向比擬。綜上，筆者以為p75NTR可作為舌鱗狀細胞癌干細胞的一種外表標志物。由于本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)p75NTR在正常舌組織中是陰性表示出的，那么針對p75NTR這個新的靶點對腫瘤進行的治療就不會對正常舌干細胞構成傷害。當然，針對臨床應用還需要更深切進入的研究，但是相信隨著研究的不斷進展，其將有望為舌癌的臨床預防和診治開拓新的思路和策略。以下為參考文獻：[1]鄭家偉,李金忠,鐘來平,等.口腔鱗狀細胞癌臨床流行病學研究現(xiàn)在狀況[J].中國口腔頜面外科雜志,2007,5(2):83-91.[2]JinH,PanY,ZhaoL,etal.p75neurotrophinreceptorsup-pressestheproliferationofhumangastriccancercells[J].Neoplasia,2007,9(6):471-478.[3]DimarasH,GallieBL.Thep75NTRneurotrophinreceptorisatumorsuppressorinhumanandmurineretinoblastomadevelopment[J].IntJCancer,2008,122(9):2023-2029.[4]KhwajaF,TabassumA,AllenJ,etal.Thep75NTRtumorsup-pressorinducescellcyclearrestfacilitatingcaspasemediatedapoptosisinprostatetumorcells[J].BiochemBiophysResCommun,2006,341(4):1184-1192.[5]DangC,ZhangY,MaQ,etal.Expressionofnervegrowthfactorreceptorsiscorrelatedwithprogressionandprognosisofhumanpancreaticcancer[J].JGastroenterolHepatol,2006,21(5):850-858.[6]MarchettiD,AucoinR,BlustJ,etal.p75neurotrophinre-ceptorfunctionsasasurvivalreceptorinbrain-metastaticmelanomacells[J].JCellBiochem,2004,91(1):206-215.[7]EramoA,LottiF,SetteG,etal.Identificationandexpan-sionofthetumorigeniclungcancerstemcellpopulation[J].CellDeathDiffer,2008,15(3):504-514.[8]CollinsAT,BerryP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