病理切片與免疫組化個人經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

免疫組織化學(xué)中對載波片和蓋波片的處理（一）載波片的清潔進(jìn)行免疫組化染色必須保證載波片的潔凈否則常導(dǎo)致非特異性染色和組織脫片現(xiàn)象的出現(xiàn)而新的載波片常有油污等可能影響免疫組化染色的異物。因此必須對載波片進(jìn)行清潔工作。常用的載波片清潔液是用重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水以不同比例混合配成不同強(qiáng)度的清潔液。1．常用清潔液的配制方法：1．1重鉻酸鉀：濃硫酸：蒸餾水=1：1：10重鉻酸鉀10g.,濃硫酸10ml,蒸餾水100ml1.2重鉻酸鉀：濃硫酸：蒸餾水=2：3：251.3重鉻酸鉀：濃硫酸：蒸餾水=2：5：252載波片的清潔方法1。1先將載波片用清潔液浸泡12-24h1．2流水沖洗后再用蒸餾水清洗3-5遍1。395%的酒精中浸泡2h,用紗布擦干1.4放入60°C烤箱中烤干或者自然晾干儲存在玻片盒內(nèi)備用（二）載玻片的表面處理在免疫組化試驗(yàn)中由于實(shí)驗(yàn)操作步驟的繁多常引起組織切片或者細(xì)胞涂片的脫落,影響檢測效果,因此常需要用粘附濟(jì)對切片進(jìn)行處理。1APES黏附劑APES是一種新型玻片黏附劑它的黏附劑機(jī)制是通過對玻璃表面的化學(xué)修飾改變玻璃表面的化學(xué)物理特性使組織切片活細(xì)胞成分牢固的貼附于玻璃表面不易脫落并可長期保存。是目前應(yīng)用最多的組織黏附劑。1.1APES工作液配制APES1ml丙酮50ml,混勻即可。1.2切片處理方法1。1。1干警的切片放入盛有丙酮的染色缸中浸泡5min1.1.2浸入APES工作液停留20-30s1.1.3純丙酮洗2次1。1。4放入烤箱37C過夜1。1。5用干凈玻片盒裝好室溫保存?zhèn)溆靡话憧纱娣虐肽暌陨?多聚賴氨酸（poly-l-lycine.pll）多聚賴氨酸水溶液是一種良好的組織黏附劑使用濃度在0。005-0。01％但是由于價格較高在免疫組化中很少用。1.1多聚賴氨酸儲備液的配制，將0.5g多聚賴氨酸充分溶于100ml蒸餾水中,4C或者-20C保存?zhèn)溆茫╬ll可反復(fù)水融）工作液可將pll原液稀釋10-50倍使用1。2切片的處理方法1。1干凈干燥切片浸入pll工作液，停留20-30S1.1.3用干凈玻片盒裝好，室溫保存?zhèn)溆靡话憧纱娣虐肽暌陨希ㄈ┥w波片的處理蓋波片的處理方法如上,處理時間可適當(dāng)縮短，清潔液浸泡2h即可（摘自常雙鎖主編醫(yī)學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)精編）石蠟切片微波修復(fù)抗原染色程序1載玻片防脫片劑處理：可選擇APES或poly-l-lycine。撈片后置烤箱58-60C30-60分鐘以上使切片緊密黏附切片常規(guī)脫蠟至水30%H2O2+蒸餾水10份混合，室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01M購船酸鹽緩沖液中（PH6。0），電路或微波爐加熱之沸騰后斷電間隔5-10分鐘后，反復(fù)1-2次。冷卻后PBS（PH7。2-7。6）洗1-2次。5滴加5％BSA封閉液室溫20分鐘，甩去多余液體不洗。6滴加適當(dāng)稀釋的抗（小鼠或兔IgG）.37°Clh左右或20°C時左右，也可4°C過夜，PBS（PH7。2-7。6）洗2分鐘X3次。（一抗的稀釋度孵育時間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系。一般來說陽性染色強(qiáng)度不夠時可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時間背景過高時可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時間）7?滴加生物素化山羊抗小鼠IgG（或兔、人IgG）,20-37C20分鐘PBS（PH7。2-7。6）洗2分鐘X3次。8滴加試劑SABC,20-37°C20分鐘.PBS（PH7。2-7。6）洗5分鐘X4次.9.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒（AR1022）。取蒸餾水lml加試劑盒中A,B,C試劑各1滴，混勻后加至切片,室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時間,一般在5-30分鐘之間.也可自配顯色劑顯色。蒸餾水洗滌。0.02MPBS（PH7。2-7。6）配法：1000ml蒸餾水中加氯化鈉&5g,Na2HP042.8g,Na2H2P040.4g.如果用的是含水磷酸鹽，應(yīng)加上分子式中水的含量。0.02M枸椽酸鹽緩沖液：1000ml蒸餾水中加枸椽酸三鈉（C6H5Na3O7?2H2O）3g,枸椽酸（C6H8O7,H2O）0.4g注意事項(xiàng)：如果染色背景較高，在SABC反應(yīng)之后，DAB顯色之前，用加水0001-0。02%TWEEN20的PBS（PH7。2-7o6）洗滌切片4次，單純PBS洗2次，然后顯色。以上摘自武漢博士德生物工程有限工程公司所產(chǎn)的即用型SABC免疫組化染色試劑和使用說明書。HE染色方法二甲苯I脫蠟10-15min二甲苯II脫蠟10-15min3無水乙醇脫二甲苯1minX2次4.95%乙醇90%乙醇6.85%乙醇7自來水洗2min蘇木蘇染色1-5min自來水洗1min10.0.5%-1%鹽酸乙醇分化20S11自來水洗1min12稀氨水（1%）返藍(lán)數(shù)秒，自來水或蒸餾水洗1min13尹紅染色1-5min14自來水洗15.85%乙醇脫水20S90%乙醇30S95%乙醇I1min95%乙醇II1min無水乙醇I2min無水乙醇II2min二甲苯I2min二甲