慢病毒載體包裝構(gòu)建過程

創(chuàng)作時間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日慢病毒載體包裝建立過程之巴公井創(chuàng)始作創(chuàng)作時間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日原理：慢病毒載體能夠?qū)⑼庠椿蚧蛲庠吹膕hRNA有效地整合到宿主染色體上，進(jìn)而達(dá)到長久性表達(dá)目的序列的成效。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種種類的細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到優(yōu)秀的的基因治療成效。關(guān)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體，能大大提升目的基因或目的shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增添，能夠比較方便快捷地實現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長久、穩(wěn)固表達(dá)。觀點：慢病毒載體是指以人類免疫缺點病毒-1(HIV-1)根源的一種病毒載體，慢病毒載體包括了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)固整合所需要的遺傳信息，是慢病毒載系統(tǒng)統(tǒng)的主要構(gòu)成部分。攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的協(xié)助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，經(jīng)過感染細(xì)胞或活體組織，實現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或活體組織中表達(dá)。協(xié)助成分：慢病毒載體協(xié)助成分包括：慢病毒包裝質(zhì)粒和可發(fā)患病毒顆粒的細(xì)胞系。慢病毒載體包括了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)固整合所需要的遺傳信息。慢創(chuàng)作時間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日創(chuàng)作時間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日病毒包裝質(zhì)粒可供給全部的轉(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的全部協(xié)助蛋白。為發(fā)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培育基中，離心獲得上清液后，能夠直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞以后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，進(jìn)而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子?；椿A(chǔ)理：慢病毒載系統(tǒng)統(tǒng)由兩部分構(gòu)成，即包裝成分和載體成分。包裝成分：由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而建立，能夠反式供給發(fā)患病毒顆粒所一定的蛋白。包裝成分往常被分開建立到兩個質(zhì)粒上，一個質(zhì)粒表達(dá)Gag和Pol蛋白，另一個質(zhì)粒表達(dá)Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。將包裝成分與載體成分的3個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞(如人腎293T細(xì)胞)，即可在細(xì)胞上清中收獲只有一次性感染能力而無復(fù)制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。載體成分：與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時擁有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點拔出的目的基因。為降低兩種成分同源重組恢復(fù)成野生型病毒的可能，需盡量減少兩者的同源性，如將包裝成分上5′LTR換成巨細(xì)胞病毒(CMV)立刻初期啟動子、3′LTR換成SV40polyA等。創(chuàng)作時間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日創(chuàng)作時間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日一、實驗流程（1和2為并列步伐）設(shè)計上下游特異性擴(kuò)增引物，同時引入酶切位點，PCR(采納高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%)從模板中（CDNA質(zhì)?；蛟S文庫）調(diào)取目的基因CDS區(qū)（codingsequence）連入T載體。將CDS區(qū)從載體上切下，裝入慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體。合成siRNA對應(yīng)的DNA頸環(huán)構(gòu)造，退火后連入慢病毒擾亂質(zhì)粒載體慢病毒載體的包裝與濃縮純化制備慢病毒穿越質(zhì)粒及其協(xié)助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6h改換為完整培育基，培育24和48h后，分別采集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液經(jīng)過超離心濃縮病毒。二、實驗資料2.1慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，構(gòu)成為pspax2,pMD2G,pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。此中質(zhì)粒上的ZsGreen1表達(dá)框能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。創(chuàng)作時間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日創(chuàng)作時間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日載體信息慢病毒克隆載體圖譜以下：2）包裝質(zhì)粒信息以下：PMD2G載體圖譜和序列信息PSPAX2載體圖譜和序列信息：細(xì)胞株293T，慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依靠型成上皮樣細(xì)胞，生長培育基為DMEM(含10%FBS)