蛋清卵類粘蛋白的分離純化

蛋清卵類蛋白的分離化一實(shí)器1.儀：計(jì)恒溫磁力攪拌器、蛋白質(zhì)核酸分析儀、自動(dòng)部份收集器、梯度混合器層析柱、紫外可見光分光光度計(jì)、空冷凍干燥機(jī)、電泳儀、電泳槽、恒溫震蕩搖床、透析袋、冷凍離心機(jī)、真干燥箱分析天平2.試：新雞蛋凝填料、DEAE-32纖素離子交換填料、卵類粘蛋白標(biāo)品、三氯乙酸(TCA)丙酮、氯化鈉Na、考馬斯亮藍(lán)、考馬斯亮24藍(lán)、丙烯酰氨、過硫酸胺、甘氨酸、二燒基硫酸鈉、乙醇、冰醋酸、碳酸氧鈉、氯化鐵、酸胺3.主溶的配及料處：10%氯酸先稱好的TCA總體積2/3的溶,用10調(diào)至1.15,后加水至所需體積。pH6.5磷酸沖:先配成倍的母液用時(shí)稀釋至mol/L;磷氧鈉-磷二鈉沖(0.02pH25）制法:0.2mol/L磷氫二鈉:HP012H071.64mL,31.5mL;220.2mol/L磷二氧鈉:NaH31.21g/1000mL;2胰白標(biāo)液用mol/LHCl配制每次用完再配;BAEE底物沖(內(nèi)mol/L:用mol/L的Tris-HCl溶解調(diào)pH至7.8;mmol/LBAEE物液:mg定至100mL底物緩沖液中,用前配置。SephadexG-25葡聚凝層析料處:稱30g用0.02mol/L,磷酸緩沖液500mL熱脹h者室溫溶脹h脫氣后裝柱。纖素子換料處理稱纖素粉DE-32)10以mLmol/Lmol/LNaCl溶浸泡20min,移到布氏漏斗中抽濾,蒸餾水洗至中(約抽水移至燒杯中再mLmol/LHCl浸然后移至布氏漏斗中抽濾以蒸饋水洗至中(大約pH6.0)最后倒在燒杯中用mLmol/L,磷酸緩沖液浸泡片刻。于真空干燥器內(nèi)脫裝柱。

二實(shí)方CHOM粗的備1.1沉雜白取雞清,加等體積的三氯醋(1.15)溶液這時(shí)出現(xiàn)大量的白色沉,拌均勻后在pH酸計(jì)上檢查pH值此時(shí)的pH值應(yīng)是。若提取液的值離pH3.5±則要用5mol/LNaOH或5mol/LHCl把pH調(diào)回到±0.2的范圍以內(nèi)提取液非常粘調(diào)要防止局部過酸或過堿。調(diào)好pH值,在室溫下靜置4h以。1.2離去雜白沉待清蛋白完全沉淀后,以r/min心10min棄去沉淀物,上清再用濾紙過濾。以濾除上清液中的脂類物質(zhì)及其他不溶性物質(zhì)。1.3冷酮淀CHOM粗收集濾液轉(zhuǎn)移到一個(gè)燒杯里。檢查濾液的值是否是3.5,若相差較大要調(diào)回到3.5放置冰浴中冷卻片刻,緩慢加入3倍積預(yù)冷丙(放在冰箱的冷藏室預(yù))玻璃棒輕輕攬勻。用塑料薄膜蓋盡量減少丙酮的發(fā)。在冰浴里放置4以上。1.4離收CHOM粗并殘留酮待CHOM全沉淀后,以4000r/min離5min,傾出上清夜。將沉淀物放在真空干燥器,抽氣除去殘留丙酮。然后用蒸餾水溶解若解渾油,則濾紙除去不溶物即CHOM提液。層柱鹽取mL粗提液上柱脫鹽(上樣量不超過柱床體積的1/6)。用0.02mol/L,pH磷緩沖液平衡并洗脫。收集洗脫峰。維離交法化CHOM將經(jīng)Sephadex脫的CHOM粗提液上柱吸附。用0.02mol/L,pH6.5磷緩沖液淋洗去除雜蛋白。流出液在核酸蛋白檢測儀上繪出穩(wěn)定的基線。然后改用0.3mol/LNaCl-0.02mol/L,pH磷緩沖液洗脫。并集活性峰。CHOM純的備4.1透除將上述收集到的溶液全部裝入透析袋內(nèi)餾水進(jìn)行透析隔段時(shí)間更換一次蒸傾

直到用l%AgN03檢無氯離子為止。4.2調(diào)透液pH及丙沉CHOM純將透析液轉(zhuǎn)移到燒杯用mol/LHC1調(diào)至4.0,后加入3倍體積的預(yù)冷丙酮。蓋上塑料薄膜在冰浴里靜置h以上。4.3CHOM純的心干待全析出后傾上剩余的沉淀物于r/min心5min棄去上清夜,淀物干燥就得到透明膠狀物一CHOM純。品定純5.1十二基酸-聚燭胺膠泳(濃縮膠濃度5%,分離膠濃度12%品2mg/mL)溶于上樣緩沖液,上樣量10uL,縮膠電泳恒壓V,離膠電泳恒壓120V凝膠用乙醇和冰醋酸固定30min,0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250染3025%醇和冰醋酸混合液進(jìn)行脫色。蛋含測以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),考馬斯亮蘭法測蛋白質(zhì)含量。具體操作步驟如:6.1標(biāo)曲線的繪制取7只干凈試管號(hào),并胺照下表所示加入試劑、混勻,室靜置3min,第一管為空白在波長下測定讀取吸光度值,以光度為縱坐標(biāo),各準(zhǔn)液濃度為縱坐標(biāo)繪圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。編號(hào)

空白27標(biāo)準(zhǔn)蛋白液加入/mL-0.20.30.60.9%NaCl加量mL1.00.90.80.70.60.4考馬斯亮藍(lán)染液加入/mL4.04.0