病毒接種、收獲尿囊液操作步驟

病毒接種選胚：首先，在照蛋間挑選出血管模糊，沒有生命跡象的雞胚。標記注射點：接著用記號筆在氣室上方約1mm處畫線，在線的下方挑選注射點，在挑選注射點時應(yīng)注意避開主血管，避開雞頭。打孔：打孔前先用碘酊在氣室部位消毒，用打孔器在氣室線上方打孔。注意:孔不宜過大，否則會導(dǎo)致封蠟不完全，甚至將蠟油流進雞胚內(nèi)部。注射病毒：用注射槍向每個雞蛋孔內(nèi)注射0.2ml病毒稀釋液，注射時針頭朝向注射點方向，每次注射停留4~6s。封蠟：注射完畢，用鑷子夾取酒精棉沾上蠟油，進行雞胚封蠟。培養(yǎng)：將封蠟完成的雞胚放入孵化箱中培養(yǎng)。孵化箱溫度設(shè)置33~35C，濕度50%~70%,甲型流感病毒培養(yǎng)48~52小時，乙型流感病毒培養(yǎng)66~72小時。需準備的儀器試劑：手電筒，記號筆，碘酊，棉簽，量筒（稀釋），酒精燈，廢液瓶，打孔器，三腳架，蠟塊，連續(xù)注射器，一次性注射器，移液槍，移液槍槍頭，鑷子，紗布，打火機，藍蓋瓶注意事項：（1）、前一天將病毒原液拿至4P冷庫；（2）、前一天準備好需要滅菌消毒的物品，高溫高壓滅菌，烘干；確定好參加實驗人數(shù)，準備好無菌服；（3）、接種當天早上將接種所需生物安全柜開紫外殺菌；收獲尿囊液雞胚消毒:將培養(yǎng)好的雞胚放入4C冷庫進行冷胚6h以上；首先，用0.1%的新潔而滅溶液將雞胚進行消毒，每次消毒1~2分鐘。接著，在雞胚的氣室z.用碘酊消毒。烙蛋：將經(jīng)過消毒處理的雞胚在烙蛋器上進行烙蛋。收獲：先用小鑷子將殼膜撕破扒出氣室，再用大鑷子壓住雞頭，同時用5ml移液槍吸取尿囊液。收獲的尿囊液應(yīng)是澄清、微黃狀。保存：將收獲的尿囊液放至6C冷庫保存。需準備的儀器試劑：新潔而滅溶液，碘酊，棉簽，烙蛋器，廢液瓶，鑷子，5ml移液槍，5ml移液槍槍頭，藍蓋瓶(數(shù)量由病毒原液體積決定)。注意事項：、前一天準備好需要滅菌消毒的物品，高溫高壓滅菌，烘干；確定好參加實驗人數(shù)，準備好無菌服；、收獲當天早上將收獲所需生物安全柜開紫外殺菌；血凝滴度試驗稀釋病毒液：取一塊潔凈的96”孔血凝板，橫向擺放。用微量移液器(20—2ul)加入磷酸鹽緩沖液1ul至第一孔，橫向從第二孔開始，每孔均用微量移液器(5—50ul)加入磷酸鹽緩沖液25ul直至第十二孔。倍比稀釋：在U”型96孔血凝板的左側(cè)標記樣品名稱，用微量移液器(5—50ul)從第一孔內(nèi)加入25ul病毒懸浮液吹打混勻，將病毒液稀釋五倍。取出25ul放到第二孔中，從第二孔開始倍比稀釋，每孔吹打混勻，稀釋到最后一孔棄掉25ul，此時的稀釋倍數(shù)為1:10240。陰性對照：在同一塊U”型6孔血凝板的最后一排，后三孔用25ul的磷酸鹽緩沖液替代供試品，作為陰性對照。加雞血：將1%雞紅細胞懸液倒入加樣槽吹打混勻，開始從第十二列至第一列每孔均用微量移液器(5-50以)加入25以的1%雞紅細胞懸液，振蕩均勻z.后置室溫40分鐘后觀察結(jié)果。結(jié)果計算：觀察陰性對照，若紅細胞于孔底形成一個小團，邊緣光滑并有立體感，將板傾斜片刻，可見紅細胞滑動呈淚滴狀為“-”，則陰性對照成立。按照《流感病毒血凝滴度檢測標準操作規(guī)程》觀察每孔凝集狀態(tài)，結(jié)果以++”（++以數(shù)字2代之）為終點，以紅細胞形成一個環(huán)狀，四周有小凝集塊者為++”亦即一個凝集單位，也就是說最高稀釋度病毒能引起+?！碧柕募t細胞凝集為終點，此稀釋度的倒數(shù)為紅細胞凝集滴度簡稱血凝滴度。影響血凝抑制實驗的因素紅細胞懸液濃度：來源于不同個體雞的紅細胞，對抗原的敏感性不盡相同。因此實驗時最好用3-4只未免疫雞。配制紅細胞時，紅細胞濃度低，HI滴度就會下降；紅細胞濃度高，HI滴度就會上升。有實驗表明，紅細胞濃度增加一倍，HI滴度就會上升，因此，紅細胞濃度以1%為宜。抗原的稀釋倍數(shù)：配制抗原時，濃度必須準確。當抗原濃度高時，皿【抗體效價就下降；當抗原濃度抵時，^【抗體效價就上升。實驗用的稀釋液仲日$）:稀釋液的pH值對實驗有影響。稀釋液的「日值5.8以下，紅細胞容易產(chǎn)生自凝現(xiàn)象；pH值在7.8以上凝集圖形易消失，也會造成實驗誤差。而pH值為7.0時，紅細胞沉降最充分，圖形最清晰，HI效價也最高，因此實驗時用的稀釋液。實驗時的溫度：實驗時的溫度，從4-37°C，隨著溫度上升，HA與HI滴度提高,但在37T時，凝集的紅細胞易洗脫；4。。以下紅細胞易產(chǎn)生自凝，故操作常用18-22C。（以上所闡述的是實驗室操作過程中存在的幾點因素，在實際工作中，也存在著其他諸多原因，如采樣的時間、采樣的數(shù)量、以及由疫苗產(chǎn)生的影響等。）流感病毒裂解疫苗生產(chǎn)工藝流程相關(guān)參數(shù)z.工藝流程相關(guān)參數(shù)接種注射0.2ml/枚收獲收獲8~10ml/枚離心澄清1rpm，1020min平板過濾0.45um超濾濃縮3KD蔗糖密度梯度