誘變物質(zhì)的微核測試

誘變物質(zhì)的微核測試一、實驗目的1、了解細胞微核形成機理及其形態(tài)特點2、學習植物根尖細胞的微核檢測方法二、實驗原理微核（micronucleus,簡稱MCN）,也叫衛(wèi)星核，是真核類生物細胞中的一種異常結(jié)構，是染色體畸變在間期細胞中的一種表現(xiàn)形式。微核往往是各種理化因子，如輻射、化學藥劑對分裂細胞作用而產(chǎn)生的。在細胞間期，微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小應在主核1/3以下。微核的折光率及細胞化學反應性質(zhì)和主核一樣，也具合成DNA的能力。一般認為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片產(chǎn)生的。有實驗證明，整條染色體或幾條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在分裂過程中行動滯后，在分裂末期不能進入主核，便形成了主核之外的核塊。當子細胞進入下一次分裂間期時，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核。已經(jīng)證實，微核率的大小是和作用因子的劑量或輻射累積效應呈正相關，這一點與染色體畸變的情況一樣。所以許多人認為可用簡易的周期微核計數(shù)來代替繁雜的中期畸變?nèi)旧w計數(shù)。由于大量新的化合物的合成，原子能的應用，各種各樣工業(yè)廢物的排出等都存在污染環(huán)境的可能性，欲了解這些因素對機體潛在的遺傳危害，需要有一套高度靈敏，技術簡單易行的測試系統(tǒng)來監(jiān)測環(huán)境的變化。只有真核類的測試系統(tǒng)更能直接推測誘變物質(zhì)對人類或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測試是一種比較理想的方法。目前國內(nèi)外不少部門已把微核測試用于輻射損傷、輻射防護、化學誘變劑、新藥試驗、食品添加劑的安全評價，以及染色體遺傳疾病和癌癥前期診斷等各個方面。三、實驗材料蠶豆：又稱胡豆、佛豆、胡豆、川豆、倭豆、羅漢豆。一年生或二年生草本。為糧食、蔬菜和飼料、綠肥兼用作物。起源于西南亞和北非。相傳西漢張騫自西域引入中國。蠶豆含8種必需氨基酸。碳水化合物含量47%?60%。營養(yǎng)價值豐富，可食用，也可制醬、醬油、粉絲、粉皮和作蔬菜。還可作飼料、綠肥和蜜源植物種植一年生或二年生草本。莖直立，四棱，中空，四角上的維管束較大。羽狀復葉。總狀花序，花蝶形。莢果，種子扁平,略呈矩圓形或近于球形。蠶豆花期一般是3月?5月。蠶豆為長日照作物。喜溫暖濕潤氣候和pH6.2?8的粘壤土。器材:顯微鏡、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱、濾紙、生物解剖器、250ml、1L容量瓶、玻璃棒、點滴板、載玻片、蓋玻片等。藥品：鹽酸、冰醋酸、龍膽紫染液、乙醇、70%酒精、重絡酸鉀、蒸餾水1.1實驗方法1?1?1選種f浸種f催芽f處理選取顆粒飽滿、色澤均勻的蠶豆種子作為實驗材料。將選取好的蠶豆種子臵于培養(yǎng)皿中加蒸餾水浸種24小時，期間換水2次。將浸泡24小時之后的蠶豆種子臵于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至生根l-2cm。稱取1g重鉻酸鉀溶于蒸餾水中，轉(zhuǎn)入1L容量瓶中定容。將生根1-2cm的蠶豆分成16份，分別用lg/L重鉻酸鉀溶液、0.5g/L重鉻酸鉀溶液（用lg/L重鉻酸鉀溶液稀釋）、0.25g/L重鉻酸鉀溶液(lg/L重鉻酸鉀溶液稀釋)處理，對照用自來水處理。每個處理均為4份)。1.1.2蠶豆根尖微核試驗(半數(shù)保留，恢復培養(yǎng)24小時后進行此項)先用卡諾氏固定液固定，后解離、染色、制片觀察卡諾氏固定液的配制：3乙醇：1冰醋酸解離液的配制：l鹽酸：l乙醇固定：切取lcm左右的根尖，用卡諾氏固定液固定24小時后棄去固定液，移入70%酒精中保存。解離：棄去固定液，用蒸餾水漂洗2次，吸凈水，加入解離液解離20分鐘，棄去解離液，蒸餾水漂洗2次。染色：截取1-2mm蠶豆根尖于點滴板內(nèi)，滴加適量的龍膽紫染色液染色10分鐘，加蓋玻片，壓片觀察，記錄有微核的細胞數(shù)目。直接解離、染色、制片觀察解離：切取lcm左右的根尖，用蒸餾水洗2次，吸凈水，加入解離液解離20分鐘，棄去解離液，蒸餾水漂洗2次。染色：截取1-2mm蠶豆根尖于點滴板內(nèi)，滴加適量的龍膽紫染色液染色10分鐘，加蓋玻片，壓片觀察，記錄有微核的細胞數(shù)目。1、數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析2.1微核形成與識別：首先在低倍鏡中找到分生組織區(qū)細胞分散均勻，分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀察，找到微核。在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。小核著色與主核相當或稍淺。小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則型。不同物質(zhì)對蠶豆根尖細胞微核的誘導效應以蒸餾水和重鉻酸鉀溶液處理蠶豆根尖后，觀察并計算其微核形成率。鏡檢發(fā)現(xiàn)微核位于細胞質(zhì)中，為與主核完全分開的圓形或橢圓形核，大小約為主核的1/3，其染色程度與主核一致或略淺于主核。分析表明，不同處理對蠶豆根尖細胞微核的誘導隨處理液不同而存在差異。不同處理蠶豆根尖細胞后的微核率在2%0?10%0之間。結(jié)果表明，重鉻酸鉀溶液誘導蠶豆根尖細胞產(chǎn)生的微核率顯著高于蒸餾水（P<0.05）。3.2不同濃度重鉻酸鉀溶液對蠶豆根尖細胞微核的誘導效應以三種不同濃度的重鉻酸鉀溶液（規(guī)兒重鉻酸鉀溶液、0.5g/L重鉻酸鉀溶液、0.25g/L重鉻酸鉀溶液）處理根尖，觀察并計算其微核率。結(jié)果表明，處理24