病毒檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用

病毒檢驗(yàn)技術(shù)VirusDetectionTechnology前言01目錄CONTENTS病毒的分別與培育02免疫學(xué)方法03病毒核酸分子檢測(cè)0405新型核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)前言01PART病毒學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)是用試驗(yàn)室檢驗(yàn)方法對(duì)臨床和流行病學(xué)現(xiàn)場(chǎng)送檢的標(biāo)本（如人或宿主的血液、組織、尿、糞便和組織液等）進(jìn)行病毒學(xué)的定性和定量分析，為病毒感染和病毒性疾病的診斷、治療和預(yù)防供應(yīng)科學(xué)依據(jù)。病毒檢驗(yàn)技術(shù)病毒檢測(cè)技術(shù)反映病毒的核酸水平、感染的狀態(tài)、傳染性和評(píng)定治療效果，對(duì)病情的診斷、治療和用藥上起著關(guān)鍵性的作用，可依據(jù)檢查結(jié)果推斷和選擇患者適宜的抗病毒藥物種類，并制定適宜的最佳治療方案；可依據(jù)病毒核酸量的動(dòng)態(tài)變更對(duì)患者用藥的劑量、時(shí)間及是否須要聯(lián)合用藥等供應(yīng)重要的參考依據(jù)。病毒檢測(cè)技術(shù)在評(píng)價(jià)和視察抗病毒藥物治療的療效、免疫增加藥物的療效及判定預(yù)后效果都有重要應(yīng)用。病毒檢驗(yàn)技術(shù)流程病毒的分別與培育主要有細(xì)胞培育法、雞胚培育法、動(dòng)物接種法等,而對(duì)細(xì)胞、雞胚不敏感,又沒有合適動(dòng)物模型的病毒,可接受基因克隆的方法。02PART細(xì)胞培育法細(xì)胞培育瓶雞成纖維細(xì)胞二倍體細(xì)胞株來源于正常人胎兒組織，主要用于培育病毒制備疫苗等；原代細(xì)胞是指從機(jī)體取出后馬上培育的細(xì)胞，原代細(xì)胞的培育是指干脆從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后馬上進(jìn)行培育；傳代細(xì)胞來源于腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞株傳代過程中變異的細(xì)胞。雞胚培育雞胚培育法是用來培育某些對(duì)雞胚敏感的動(dòng)物病毒的一種培育方法，此方法可用以進(jìn)行多種病毒的分別、培育，毒力的滴定，中和試驗(yàn)以及抗原和疫苗的制備等。一般選用9～14d的雞胚優(yōu)點(diǎn):來源足夠、組織分化程度低、本身很少攜帶病毒和細(xì)菌、對(duì)接種病毒不產(chǎn)生抗體及病毒較易增殖等不同病毒在雞胚的不同部位的生長(zhǎng)特性差異很大，選擇不同的接種部位是病毒分別成功的關(guān)鍵：尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種尿囊腔接種：常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的適應(yīng)和傳代培育動(dòng)物接種常用的試驗(yàn)動(dòng)物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和雞等；常用的接種途徑包括皮下、皮內(nèi)、腹腔、靜脈、角膜、鼻腔及腦內(nèi)接種等方式；病毒增殖的視察病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的鑒定指標(biāo)1．細(xì)胞形態(tài)的變更2．紅細(xì)胞吸附3．細(xì)胞培育液pH值變更病毒數(shù)量及病毒感染性測(cè)定1．血凝試驗(yàn)2．中和試驗(yàn)3．空斑形成試驗(yàn)4．半數(shù)感染量（ID50）和組織培育半數(shù)感染量（TCID50）紅細(xì)胞吸附包涵體細(xì)胞形態(tài)變更光學(xué)顯微鏡形態(tài)學(xué)檢查及診斷干脆視察到較大的病毒體（如痘病毒）、包涵體狂犬病毒感染——嗜酸性包涵體。掃描電子顯微鏡用于視察病毒和細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)和附屬結(jié)構(gòu)等。透射電子顯微鏡用于視察病毒的大小、形態(tài)與結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)等?？瞻咝纬稍囼?yàn)是一種檢查和精確測(cè)定病毒滴度的方法。將稀釋的病毒懸液加入單層細(xì)胞培育瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層溶化的半固體養(yǎng)分瓊脂，使病毒在單層細(xì)胞培育中有限擴(kuò)散。結(jié)果是每一個(gè)有感染性的病毒在單層細(xì)胞中可產(chǎn)生一個(gè)局限性的感染灶。用活性染料(如中性紅)染色，則活細(xì)胞著色，受病毒感染而破壞的細(xì)胞不著色，形成肉眼可見的空斑/蝕斑(plaque)。每個(gè)蝕斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒形成的，稱作空斑形成單位(plaqueformingunit,PFU)。病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFU／ml表示。免疫學(xué)方法03PARTELISA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）接受抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最終結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成確定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量干脆相關(guān)，故可依據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。病毒核酸分子檢測(cè)04PART基因芯片基因芯片(genechip)又稱基因微矩陣(DNAmicroarry)具有微型化、高通量、并行處理易于自動(dòng)化等優(yōu)越性,它將大量的靶基因片段有序、高密度地排列在玻片、硅等載體上,用熒光檢測(cè)后,通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)比較和分析,一次試驗(yàn)就可對(duì)上萬種基因進(jìn)行快速、精確、高效的檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR目前最有效、最靈敏的方法就是實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtimeRT-PCR），依據(jù)目標(biāo)核酸基因來設(shè)計(jì)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)，已廣泛應(yīng)用在臨床樣品的檢測(cè)。realtimeRT-PCR是將熒光能量傳遞技術(shù)應(yīng)用于PCR儀中，在PCR的反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用獲得的熒光信號(hào)積累來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最終通過得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知得模板進(jìn)行定量分析的方法。新型核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)05PARTNASBANASBA（Nuclearacidsequence-basedamplification，核酸依靠性擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)）是一項(xiàng)以RNA模板進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增并能實(shí)時(shí)觀測(cè)結(jié)果的檢測(cè)方法。該技術(shù)的檢測(cè)反應(yīng)有賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、噬菌體T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、兩種特殊設(shè)計(jì)的特異性寡核苷酸引物和分子信標(biāo)探針共同協(xié)作而完成。相對(duì)于免疫學(xué)方法或其他基因檢測(cè)法，NASBA速度快，特異性強(qiáng)，敏感性高，檢測(cè)范圍廣泛，缺點(diǎn)在于成本較高。雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)HCR雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HybridizationChainReaction,HCR）是由Dirks與Pierce于2004年提出的一種高效的核酸擴(kuò)增方法，依據(jù)核酸探針競(jìng)爭(zhēng)性雜交形成長(zhǎng)度不等的亞穩(wěn)態(tài)核酸雙鏈實(shí)現(xiàn)輸出信號(hào)的放大。HCR反應(yīng)在室溫下即可，無需變溫調(diào)整、酶的協(xié)助及其它試劑的參與，在核酸信號(hào)擴(kuò)增方面得到廣泛應(yīng)用。HCR反應(yīng)體系由一段啟動(dòng)探針I(yè)，兩段發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)探針H1、H2構(gòu)成，H1與H2發(fā)夾環(huán)探針結(jié)構(gòu)相像，分為環(huán)部、莖部以及粘性末端三個(gè)部分，啟動(dòng)探針引發(fā)兩段功能性核酸探針競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，形成亞穩(wěn)態(tài)的核酸雙鏈，從而實(shí)現(xiàn)HCR反應(yīng)。HCR介導(dǎo)的比色方法比色法主要通過顏色的變更來實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。將HCR反應(yīng)與形成G-四連體結(jié)構(gòu)結(jié)合用于檢測(cè)一段TBV寡核苷酸序列。HCR介導(dǎo)的熒光檢測(cè)方法熒光因其特有的發(fā)光性質(zhì)，可通過儀器檢測(cè)熒光信號(hào)值的變更實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，結(jié)合HCR信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)后會(huì)將信號(hào)放大輸出，實(shí)現(xiàn)更加靈敏的檢測(cè)?；贖CR介導(dǎo)的核酸檢測(cè)方法HCR介導(dǎo)的納米金方法

當(dāng)靶標(biāo)與兩段探針通過HCR反應(yīng)結(jié)合不斷形成核酸雙鏈結(jié)構(gòu)，核酸探針就會(huì)從納米金上脫落下來，使得納米金在鹽溶液中發(fā)生聚集，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色。通過肉眼觀測(cè)到溶液顏色的變更，實(shí)現(xiàn)了核酸可視化的檢測(cè)。HCR反應(yīng)與電化學(xué)方法相結(jié)合

發(fā)夾環(huán)核酸探針固定在電極上，通過與待檢靶標(biāo)以及核酸引物堿基互補(bǔ)后，在dNTP與聚合酶作用下，循環(huán)形成多個(gè)帶有可啟動(dòng)HCR序列的引物，與標(biāo)記Biotin的H1、H2進(jìn)行HCR反應(yīng)，特異性與標(biāo)記SA的堿性磷酸化酶在電極上產(chǎn)生電信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)。自動(dòng)化高通量可視化集約化規(guī)?；《緳z測(cè)技術(shù)中