實(shí)驗(yàn)四外源基因的多重檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)四外源基因的多重檢測(cè)第一頁，共二十頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^多重PCR，比較、分析影響多重PCR的主要因素，掌握解決方法。掌握多重PCR引物設(shè)計(jì)的原則和方法，確立多重PCR方法快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中外源基因整合的條件，為更深一步應(yīng)用多重PCR檢測(cè)技術(shù)奠定基礎(chǔ)第二頁，共二十頁，2022年，8月28日一多重PCR技術(shù)的基本原理

多重PCR方法目前在植物生物學(xué)研究上應(yīng)用非常廣泛，包括植物種質(zhì)鑒定，植物病毒的檢測(cè)和分子育種。多重PCR的關(guān)鍵是引物設(shè)計(jì)，主要原則就是避免引物內(nèi)部形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，引物及引物之間在擴(kuò)增過程中產(chǎn)生二聚體。其他條件例如模板純度，退火溫度也能夠影響PCR擴(kuò)增效果。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。第三頁，共二十頁，2022年，8月28日二PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示每次擴(kuò)增效率的平均值，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期(Plateau)。第四頁，共二十頁，2022年，8月28日平臺(tái)期產(chǎn)生的因素

①dNTP和引物濃度下降②酶與模板的比例下降，能參與反應(yīng)的酶分子數(shù)下降③多次循環(huán)后酶與dNTP的穩(wěn)定性下降④非特異產(chǎn)物及引物二聚體比例增加⑤產(chǎn)物濃度高時(shí)變性不完全，影響引物的延伸，并產(chǎn)物濃度過高>10－8M時(shí)，降低Taq酶的延伸與加工能力。第五頁，共二十頁，2022年，8月28日第六頁，共二十頁，2022年，8月28日設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸對(duì)于較短靶基因（長度為100～300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸第七頁，共二十頁，2022年，8月28日第八頁，共二十頁，2022年，8月28日①變性溫度與時(shí)間變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性若低于93℃則需延長時(shí)間但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗第九頁，共二十頁，2022年，8月28日②退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想第十頁，共二十頁，2022年，8月28日引物的復(fù)性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合第十一頁，共二十頁，2022年，8月28日③延伸溫度與時(shí)間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴(kuò)增10Kb需延伸至15min延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長些第十二頁，共二十頁，2022年，8月28日

引物設(shè)計(jì)第十三頁，共二十頁，2022年，8月28日引物設(shè)計(jì)根據(jù)bt，nptII和gus序列特征，使用oligo6.67結(jié)合primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)三對(duì)引物，用于多重PCR和單重PCR擴(kuò)增。引物參見表1。表1擴(kuò)增DNA模板引物對(duì)的方向、長度、Tm值、GC含量以及理論上擴(kuò)增產(chǎn)物的大小等相關(guān)參數(shù)Amplifiedgene擴(kuò)增基因Polarity方向Name名稱primersequence引物序列Lengh長度TmTm值GC%GC含量Productsize(bp)產(chǎn)物長度Bt+Bt-F5'aacggtagattcgctggat3'1954.547.4247-Bt-R5'cagaagttccagagccaag3'1952.752.6NptII+NptII-F5’tccggccgcttgggtggaga3’2059.858.3449-NptII-R5’tggcgcgagcccctgatgct3’2058.758.8Gus+GUS-F5’gcaactggacaaggcacta3’1953.952.6668-GUS-R5’agcgtcgcagaacattaca3’1954.747.4第十四頁，共二十頁，2022年，8月28日常規(guī)引物對(duì)不適于多重PCR檢測(cè)，因?yàn)閿U(kuò)增過程中引物之間的干擾，產(chǎn)物片段長度的重疊都會(huì)影響多重PCR的準(zhǔn)確性。為了防止在PCR過程中產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，每對(duì)引物的設(shè)計(jì)都應(yīng)當(dāng)有相近的Tm值，GC%含量和長度，產(chǎn)物大小能夠保證相差大于150bp，這樣可以在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)產(chǎn)生可以區(qū)分的條帶。引物產(chǎn)生的發(fā)卡結(jié)構(gòu)及二聚體的形成檢測(cè)由程序(.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfoldsimple.html)完成。第十五頁，共二十頁，2022年，8月28日檢測(cè)三個(gè)外源基因是否整合在基因組中反應(yīng)體系：三對(duì)引物應(yīng)用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，體系30μL，含10×PCRbuffer3μL，dNTPmixture(2.5mM)2.5μL，，引物(5μM)各2μL，模板DNA(50ng/μL)2μL，Taq酶(5U/μL)0.3U，雙蒸水補(bǔ)足30μL。時(shí)間設(shè)置94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火30s，72℃保持45s，共運(yùn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，梯度PCR采用如下設(shè)置：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55～65℃30s，72℃保持45s，共運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，確定最佳的退火溫度，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。第十六頁，共二十頁，2022年，8月28日10×PCRbuffer3μLdNTPmixture(2.5mM)2.5μL引物(5μM)各2μL模板DNA(50ng/μL)2μLTaq酶(5U/μL)0.3U雙蒸水補(bǔ)足至30μL梯度PCR采用如下設(shè)置：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55～65℃30s，72℃保持45s，共運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。本次實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)置94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃保持45s，共運(yùn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，檢測(cè)三個(gè)外源基因是否整合在基因組中反應(yīng)體系：第十七頁，共二十頁，2022年，8月28日擴(kuò)增條件設(shè)置樣品：待測(cè)轉(zhuǎn)基因植物DNA陽性對(duì)照：質(zhì)粒DNA陰性對(duì)照：未轉(zhuǎn)化的同一無性系植株多重PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性3min94℃變性30s58℃復(fù)性45s