生化分離考點(diǎn)

生化分離過程的特點(diǎn)：（1）生物物質(zhì)的生活活性大多是在生物體內(nèi)的溫和條件下維持并發(fā)揮作用的；（2）用作醫(yī)藥、食品和化妝品的生物產(chǎn)物與人類生命息息相關(guān)；（3）原料液中常存在與目標(biāo)分子在結(jié)構(gòu)、構(gòu)成成分等理化性質(zhì)上極其相似的分子及異構(gòu)體，形成用常法難于分離的混合物；（4）原料液中目標(biāo)產(chǎn)物的濃度一般很低，有時(shí)甚至是微量的。分離效率的評(píng)價(jià)（三個(gè)指標(biāo)）：濃縮程度、分離純化程度、回收率Stokes沉降方程 d2（p—p）g式中，dp為固體顆粒徑（m），8口為固體密度（kg/m3）,pl為液體密度（kg/m3）,g為重力加速度（kg/m3），Vg為重力沉降速度（kg/m3），pl為液體黏度。區(qū)帶分離法：是生化研究中的重要分離手段，根據(jù)立新操作條件不同，分為差速區(qū)帶離心和平衡區(qū)帶離心，兩種區(qū)帶離心法均事先在離心管中用某種低分子溶質(zhì)調(diào)配好密度梯度，在密度梯度之上加待處理的料液后進(jìn)行離心操作。離心分離設(shè)備：常用的有管式和碟片式兩大類。革蘭氏陰性和陽(yáng)性的區(qū)別：革蘭陽(yáng)性菌的細(xì)胞主要由肽聚糖層組成，而革蘭陰性菌的細(xì)胞壁在肽聚糖層的外側(cè)還有分別由脂蛋白和脂多糖及磷脂構(gòu)成的兩層外壁層。革蘭陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁比較厚，約15-50nm，肽聚糖含量占40%-90%；革蘭陰性菌的肽聚糖層約1.5-2.0nm,外壁層約8-10nm。因此，革蘭陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁比革蘭陰性菌堅(jiān)固，較難破碎。習(xí)題：管式離心機(jī)的轉(zhuǎn)筒內(nèi)徑為12cm，筒長(zhǎng)70cm，轉(zhuǎn)數(shù)為15000r/min。設(shè)離心機(jī)的校正系數(shù)為一，利用其濃縮酵母細(xì)胞懸浮液，處理能力為4.0L/min。（1）計(jì)算酵母細(xì)胞的重力沉降速度；（2）破碎該酵母細(xì)胞后，細(xì)胞碎片直徑減小到原細(xì)胞的1/2，液體黏度上升3倍，在相同條件下離心濃縮該細(xì)胞破碎液，試計(jì)算此時(shí)離心機(jī)的處理能力。2Lr2w(1)Qg2兀Lr2w22Q(1)Qg2兀Lr2w22gg=4.18x10-7m/=4.18x10-7m/s2X3，14X0,7X0，122X(15000)2(2)d=2(2)d=2d,卩2P1 L2=p,vL1g21=V16g18.鹽析原理：蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的溶液中溶解度降低、發(fā)生沉淀的現(xiàn)象稱為鹽析（Salting-out）。當(dāng)離子強(qiáng)度較高時(shí)，溶解度的對(duì)數(shù)與離子強(qiáng)度之間呈線性關(guān)系，用Cohn經(jīng)驗(yàn)方程描述：logS=p—KIS-蛋白質(zhì)的溶解度，g/LSB-常數(shù);Ks—鹽析常數(shù)；I—離子強(qiáng)度，mol/L蛋白質(zhì)的水溶液逐漸加入電解質(zhì)時(shí)，開始階段蛋白質(zhì)的活度系數(shù)降低，并且蛋白質(zhì)吸附鹽離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)分子間相互排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間相互作用卻加強(qiáng)，因而蛋白質(zhì)的溶解度增大，這種現(xiàn)象稱為鹽溶（salting-in）。隨著離于強(qiáng)度的增大，蛋白質(zhì)表面的雙電層厚度降低，靜電排斥作用減弱，同時(shí)，由于鹽離子的水化作用使蛋白質(zhì)表面疏水區(qū)附近的水化層脫離蛋白質(zhì)，暴露出疏水區(qū)域，從而增大了蛋白質(zhì)表面疏水區(qū)之間的疏水相互作用，容易發(fā)生凝聚，進(jìn)而沉淀。這種現(xiàn)象稱為鹽析（salting-out）9.影響鹽析的因素:無(wú)機(jī)鹽的種類、濃度、溫度和pH值。10.陽(yáng)離子，陰離子鹽析作用的順序：陰離子的鹽析作用順序?yàn)镻03->S02->CHCOO->CI->NO3—>C1O4->I->SCN-44陽(yáng)離子的鹽析作用的順序?yàn)镹H；>K+>Na+>Mg2+習(xí)題2：有100L蛋白質(zhì)溶液，其中含牛血清白蛋白(BSA)和另一種雜蛋白(X)，質(zhì)量濃度分別為10g/L和5g/L,擬用硫酸銨沉淀法處理該溶液，回收沉淀中的BSA。20°C下BSA和X的Cohn方程參數(shù)列于下表(假設(shè)其他蛋白的存在不影響方程參數(shù))，其中離子強(qiáng)度用硫酸銨濃度表示，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度單位為g/L，硫酸銨濃度單位為mol/L.蛋白質(zhì) 0 KsBSA21.67.65X20.06.85如果溶液體積變化與硫酸銨加入量成正比，若回收90%的BSA,需要加入多少硫酸銨?沉淀中BSA的純度是多少？=3c，i解：按體積不變（1）lg=0—KI, I=2.823=—^2xcx12+1xcx22）=3c，is1 S2i2.823S=10%x10=1g/L,c=—=0.941，加入（NH）SO0.94x11x）0=32kg2,442 4lgX=20.0—6.85I=20.0—6.85x2.823=—0.38,X=4.59g/L90%x10g/Lx100L-f \ 95.6%（5-4.59）g/Lx100L+90%x10g/Lx100L11?膜在分離過程中具有如下功能：①物質(zhì)的識(shí)別與透過；②界面；③反應(yīng)場(chǎng)。反滲透(Reverseosmosis，RO)超濾(Ultrafiltration，UF)微濾(Microfiltration，UF)透析(Dialysis，DS)電滲析(Elecrodialysis，ED)滲透氣化(Pervaporation，PV)超濾和微濾及RO都是利用膜的篩分性質(zhì)，以壓差為傳質(zhì)推動(dòng)力。反滲透RO膜無(wú)明顯的孔道結(jié)構(gòu)，透過機(jī)理多采用溶解-擴(kuò)散模型表述；反滲透的操作壓力常達(dá)到幾十個(gè)大氣壓;隨著壓力升高，溶劑的體積通量線性增大，而溶質(zhì)的質(zhì)量通量與壓力無(wú)關(guān);提高反滲透操作壓力有利于實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)的高度濃縮(適用于1nm以下小分子的濃縮)超濾(UF)和微濾(MF)都是利用膜的篩分性質(zhì)，以壓差為傳質(zhì)推動(dòng)力；UF膜和MF膜具有明顯的孔道結(jié)構(gòu)，主要用于截留高分子溶質(zhì)或固體微粒；操作壓力低，膜的透過通量與壓差成正比，與濾液粘度成反比；UF法適用于分離或濃縮直徑1一50nm的生物大分子(蛋白質(zhì)、病毒等)；MF法適用于細(xì)胞、細(xì)菌和微粒子的分離，目標(biāo)物質(zhì)的大小范圍為0.01卩m?10ym。透析過程以濃差為傳質(zhì)推動(dòng)力，膜的透過通量很小；常用于腎衰竭患者的血液透析，在生物分離方面，主要用于生物大分子溶液的脫鹽。電滲析是利用分子的荷電性質(zhì)和分子大小的差別進(jìn)行分離的膜分離法；所用的膜材料為離子交換膜；在工業(yè)上多用于海水和苦水的淡化以及廢水處理；作為生物分離技術(shù)，電滲析可用于氨基酸和有機(jī)酸等生物小分子的分離純化。滲透氣化又稱膜蒸餾，根據(jù)溶質(zhì)間透過膜的速度不同，使混合物得到分離；滲透氣化膜主要為多孔聚乙烯膜、聚丙烯膜和含氟多孔膜；適用于共沸物和揮發(fā)度相差較小的雙組分溶液的分離。對(duì)膜材料的要求：起過濾作用的有效膜厚度小，開孔率高，過濾阻力?。荒げ牧蠟槎栊裕晃饺苜|(zhì)(蛋白質(zhì)、細(xì)胞等)，不易污染，膜孔不易堵塞；適用的pH和溫度范圍廣，耐高溫滅菌，耐酸堿清洗劑，穩(wěn)定性高，使用壽命長(zhǎng)；容易通過清洗恢復(fù)透過性能；能滿足實(shí)現(xiàn)分離目的的各種要求。對(duì)稱和不對(duì)稱膜的區(qū)別：對(duì)稱膜(symmetricmembrane):傳質(zhì)阻力大，透過通量低，并且容易污染，清洗困難；不對(duì)稱膜(asymmetricmembrane):透過通量大、膜孔不易堵塞、容易清洗。膜組件:管式膜組件、平板膜組件、螺旋卷式膜組件、中空纖維式膜組件；管式面膜組件:內(nèi)徑較大，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，適合于處理懸浮物含量較高的料液;清洗比較容易;單位體積的過濾表面積(即比表面積)小。平板膜組件:平板膜組件比管式膜組件比表面積大得多；實(shí)驗(yàn)室中使用將一張平板膜固定在容器底部的攪拌槽式過濾器。螺旋卷式膜組件:比表面積大，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，價(jià)格較便宜；處理懸浮物濃度較高的料液時(shí)容易發(fā)生堵塞現(xiàn)象。中空纖維式膜組件:耐壓能力較高；可以采用外壓式操作和內(nèi)壓式操作。濃度極化模型:在膜分離操作中，所有溶質(zhì)均被透過液傳送到膜表面上，不能完全透過膜的溶質(zhì)受到膜的截留作用，在膜表面附近升高。這種在膜表面附近濃度高于主體濃度的現(xiàn)象稱為濃度極化或濃差極化(concentrationpolarization)。截留相對(duì)分子量:通過測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量不同的球形蛋白質(zhì)或水溶性聚合物的截留率，可獲得膜的截留率與溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量之間的關(guān)系曲線，即截留曲線，一般在截留曲線上截留率為0.9(90%)的溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量定義為膜的截留相對(duì)分子質(zhì)量(molecularmasscut-off,MMCO)。16..膜污染的主要原因:凝膠極化引起的凝膠層；溶質(zhì)在膜表面的吸附層；膜孔堵塞；膜孔內(nèi)的溶質(zhì)吸附。清洗:選用水、鹽溶液、稀酸、稀堿、表面活性劑、絡(luò)合劑、氧化劑和酶溶液等為清洗劑；使用清洗劑時(shí)要根據(jù)膜的性質(zhì)和污染物的性質(zhì)而定，即使用的清洗劑要具有良好的去污能力，同時(shí)又不能損害膜的過濾性能；清洗的結(jié)果能夠提高膜的透過性能，而且可延長(zhǎng)膜的使用壽命。膜分離法的應(yīng)用:細(xì)胞培養(yǎng)基的除菌；(1)發(fā)酵或培養(yǎng)液中細(xì)胞的收集或除去；(2)細(xì)胞破碎后碎片的除去；(3)發(fā)酵或培養(yǎng)液中細(xì)胞的收集或除去；(4)目標(biāo)產(chǎn)物部分純化后的濃縮或洗濾除去小分子溶質(zhì)；(5)最終產(chǎn)品的濃縮和洗濾除鹽；(6)制備用于調(diào)制生物產(chǎn)品和清洗產(chǎn)品容器的無(wú)熱原水。萃取定義:利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法稱為萃取。原理萃取是一種初步分離純化技術(shù)，根據(jù)參與溶質(zhì)分配的兩相不同而分為多種，如液固萃取、液液有機(jī)溶劑萃取、雙水相萃取和超臨界流體萃取等，每種方法均各具特點(diǎn)，適用于不同種類生物產(chǎn)物的分離純化。xdxydy18?萃取傳質(zhì)單元數(shù)：NTU=Jxo ,NTU=Jyo 分別為料液相和萃取相的總傳x xix-x*y yiy*-yUU質(zhì)單兀數(shù)；傳質(zhì)單兀高度：HTU—x,HTU=y分別為料液相和萃取相的總傳質(zhì)xKayKaxy單元高度19?雙水相萃取法(Aqueoustwo-phaseextraction)，又稱雙水相分配法(Aqueoustwo—phasepartitioning)。原理：某些親水性高分子聚合物的水溶液超過一定濃度后可形成兩相，并且在兩相中水分均占很大比例，即形成雙水相系統(tǒng)(aqueoustwo-phasesystem，ATPS)。系線的長(zhǎng)度是衡量?jī)上嚅g相對(duì)差別的尺度，系線越長(zhǎng)，兩相間的性質(zhì)差別越大，反之則越小。

當(dāng)系線長(zhǎng)度趨向于零時(shí)，即在圖的雙節(jié)線上K點(diǎn)，兩相差別消失，任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1,因此K點(diǎn)稱為臨界點(diǎn)（criticalpoint）。20.影響分配系數(shù)的各種因素：（1）成相聚合物和濃度；（2）鹽的種類和濃度；（3）pH值；（4）溫度21.相平衡與相分離雙水相萃取過程包括以下幾個(gè)步驟1.雙水相的形成溶質(zhì)在雙水相中的分配雙水相的分離22.液膜萃??；可同時(shí)實(shí)現(xiàn)萃取和反萃取這是液膜萃取法的主要優(yōu)點(diǎn)之一,對(duì)于簡(jiǎn)化