病毒的分類和微生物檢驗專家講座

病毒分類

一、分類標(biāo)準(zhǔn)

核酸性質(zhì)與結(jié)構(gòu)病毒大小與形態(tài)衣殼對稱性和殼粒數(shù)目有沒有包膜對理化原因敏感性抗原性生物學(xué)特征（繁殖方式、宿主范圍、傳輸路徑和致病性）病毒的分類和微生物檢驗專家講座第1頁二、病毒分類系統(tǒng)和命名（一）病毒分類普通系統(tǒng)病毒分類系統(tǒng)將病毒分類為科(families)、屬(genera)、種(species)等三級，或科、亞科、屬、種等四級。依據(jù)病毒體形態(tài)、基因結(jié)構(gòu)和復(fù)制模式等特征將病毒分為科和亞科；在科或亞科中又依據(jù)理化特征和血清學(xué)特性等分病毒屬，屬名后綴為—virus，屬下分為不一樣病毒種。病毒的分類和微生物檢驗專家講座第2頁分類

可將病毒分為科、亞科和屬

慣用核酸類型分類1DNAvirus(DNA病毒中有9科)2RNAvirus(ssRNA－7科.ssRNA＋7科.dsRNA2科)3反轉(zhuǎn)錄病毒(DNA和RNA反轉(zhuǎn)錄病毒中有2科)

依傳輸方式和感染部位分類1蟲媒病毒2腸道病毒3呼吸道病毒4肝炎病毒5性傳輸病毒（二）非尋常病毒分類1衛(wèi)星病毒（satellites）2類病毒（viroids）3朊粒（prion）病毒的分類和微生物檢驗專家講座第3頁

第三節(jié)

病毒學(xué)診療

本身免疫病和腫瘤親密相關(guān)。病毒性疾病在人類疾病中占有十分主要地位。

因為病毒感染防治標(biāo)準(zhǔn)不一樣于細(xì)菌等其它微生物，盡早判定病人感染或某傳染病流行是由病毒所致，是醫(yī)生和微生物學(xué)試驗室責(zé)任和任務(wù)。

病毒分離與判定當(dāng)然是病毒病原學(xué)診療金標(biāo)準(zhǔn)，但因病毒是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，病毒分離必須

有活細(xì)胞支持，故病毒分離判定較困難。病毒的分類和微生物檢驗專家講座第4頁

一、標(biāo)本采集、運(yùn)輸和處理1.應(yīng)在感染早期（發(fā)病1～2天內(nèi)）采集。2.必須無菌操作，對用于病毒分離培養(yǎng)污染標(biāo)本用高濃度抗生素處理過夜，必要時需加抗真菌藥品等3.及時送檢，送檢組織等可放入含有抗生素50%甘油緩沖鹽水或二甲基亞砜中低溫冷藏。4.血清學(xué)檢驗標(biāo)本，尤其檢測抗病原體IgG型抗體，應(yīng)分別在發(fā)病早期和恢復(fù)期采集雙份血清，只有當(dāng)恢復(fù)期血清抗體效價比早期升高4倍或以上，才含有確診意義。病毒的分類和微生物檢驗專家講座第5頁分離培養(yǎng)判定(污染標(biāo)本用抗生素處理過夜)快速診療雞胚紅細(xì)胞凝集試驗紅細(xì)胞凝集抑制試驗細(xì)胞培養(yǎng)CPE電鏡檢測中和試驗TCID50pfu測定MOI測定動物接種觀察發(fā)病情況中和試驗免疫學(xué)檢測ID50測定LD50測定形態(tài)學(xué)電鏡觀察病毒顆粒（大小、形態(tài)）光學(xué)顯微鏡觀察包涵體抗原檢測ELISAIFRIAWB核酸檢測核酸電泳核酸雜交PCR基因芯片基因測序抗體檢測ELISARIAIFWB病毒成份檢測

標(biāo)本采集

病毒的分類和微生物檢驗專家講座第6頁二、病毒分離與判定

以下情況需考慮進(jìn)行病毒分離與判定：

1.病程長且診療困難病人。

2.懷疑為新現(xiàn)病毒（emergentvirus）感染或已被毀滅

病毒性疾病懷疑“死灰復(fù)燃”。

3.為判別臨床上含有相同癥狀疾病。

4.監(jiān)測所用減毒活疫苗。

5.用于病毒生物學(xué)性狀研究或流行病學(xué)調(diào)查等。

病毒的分類和微生物檢驗專家講座第7頁（一）病毒分離培養(yǎng)

1．細(xì)胞培養(yǎng)：原代培養(yǎng)細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株、傳代細(xì)胞

系或株

標(biāo)本接種后溶細(xì)胞型感染病毒可致細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病毒

效應(yīng)（CPE），穩(wěn)定感染病毒細(xì)胞并不出現(xiàn)顯著病變，但被感染細(xì)胞膜表面會表示病毒蛋白等標(biāo)志物，如血凝素、神經(jīng)氨酸酶、病毒特異性抗原等。

2．雞胚培養(yǎng)和動物接種：

流感病毒分離培養(yǎng)雖可用犬腎傳代細(xì)胞（MDCK）,

但雞胚接種仍是最慣用敏感而特異方法。

動物接種是最原始分離病毒方法，但當(dāng)前少用。病毒的分類和微生物檢驗專家講座第8頁（二）病毒判定

1．病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖判定指標(biāo)

（1）細(xì)胞病變（cytopathiceffect,CPE

）

大多數(shù)病毒屬溶細(xì)胞型感染，在敏感細(xì)胞內(nèi)增殖會出現(xiàn)CPE。CPE表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)顆粒增多、圓縮、聚集、融合，有可形成包涵體，出現(xiàn)細(xì)胞溶解、脫落、死亡等。

不一樣病毒CPE特征不一樣。所以，觀察病毒所致

CPE特點(diǎn)，依據(jù)細(xì)胞類型，細(xì)胞病變種類可對標(biāo)本中感染病毒進(jìn)行判定。病毒的分類和微生物檢驗專家講座第9頁脊髓灰質(zhì)炎病毒感染所致CPEa.未感染vero細(xì)胞（一個非洲綠猴腎細(xì)胞系）b.脊髓灰質(zhì)炎病毒感染vero細(xì)胞（顯示細(xì)胞圓縮、分散、壞死、脫落）。

病毒的分類和微生物檢驗專家講座第10頁（2）紅細(xì)胞吸附（hemadsorption）

包膜上帶有血凝素病毒感染敏感細(xì)胞后，血凝素會出現(xiàn)于細(xì)胞膜表面，使感染細(xì)胞能與加入紅細(xì)胞結(jié)合出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，這是檢測正粘病毒和副粘病毒間接指標(biāo)。

（3）中和試驗（neutralizationtest,NT）

用抗某病毒血清先與待測病毒懸液混合，經(jīng)作用一定時間后接種敏感細(xì)胞，培養(yǎng)后觀察CPE或紅細(xì)胞吸附現(xiàn)是否消失，即特異性抗體是否能中和對應(yīng)病毒感染。如用不一樣濃度抗血清進(jìn)行中和試驗，還可依據(jù)抗體效價對待測病毒液進(jìn)行半定量檢測。病毒的分類和微生物檢驗專家講座第11頁

（1）空斑形成試驗（plaqueformation）

（2）50%組織細(xì)胞感染量

（3）感染復(fù)數(shù)

（Multiplicityofinfection,MOI）

2．病毒感染性測定及病毒數(shù)量測定

病毒的分類和微生物檢驗專家講座第12頁三、病毒感染快速診療

病毒分離與判定是病毒診療金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床試驗室應(yīng)用困難，而且費(fèi)時，對臨床病毒感染癥診治幫助不大?？焖僭\療主要指臨床標(biāo)本繞過分離培養(yǎng)復(fù)雜而較長過程，直接在電鏡下觀察病毒顆粒，或直接檢測標(biāo)本中病毒成份和IgM抗體等，以作出快速和早期診療。病毒的分類和微生物檢驗專家講座第13頁

（一）形態(tài)學(xué)檢驗

1．電鏡和免疫電鏡檢驗

含有高濃度病毒顆粒（≥107顆粒/ml）樣品，可直接應(yīng)用電鏡技術(shù)觀察。對含低濃度病毒樣本可用免疫電鏡技術(shù)，或用超速離心機(jī)將標(biāo)本離心進(jìn)行電鏡觀察，以提升檢出率和特異性。電鏡下不但能觀察病毒形態(tài)學(xué)特征，還可測量病毒大小。

2．光學(xué)顯微鏡檢驗

病理標(biāo)本或含有脫落細(xì)胞及針吸細(xì)胞標(biāo)本檢測病毒包涵體。包涵體對病毒診療有一定價值。觀察病毒CPE。病理標(biāo)本依據(jù)病理特征，再配合組化染色技術(shù)進(jìn)行診療。

病毒的分類和微生物檢驗專家講座第14頁

（二）病毒蛋白抗原檢測

1.酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA）

2.免疫熒光標(biāo)識技術(shù)（IF）

3.放射免疫標(biāo)識（SPRIA）

這些技術(shù)操作簡便、特異性強(qiáng)、敏感性高。尤其使用單克隆抗體標(biāo)識技術(shù)可測到ng（10-9g）至pg（10-12g）水平抗原或半抗原。其中因為放射性核酸可引發(fā)放射性污染，已逐步被非放射性標(biāo)識物（如地高辛等）所代替。

病毒的分類和微生物檢驗專家講座第15頁

（三）早期抗體檢測1．IgM型特異抗體檢測檢測病毒感染機(jī)體產(chǎn)生特異性IgM，如孕婦羊水中查到IgM型特異抗體可早期診療一些病毒引發(fā)胎兒先天性感染；IgM抗體測定有利于早期診療，但感染機(jī)體產(chǎn)生IgM抗體有顯著個體差異。2．免疫印跡試驗（Westernblot,WB）一些病毒感染診療需持慎重認(rèn)真作法。如AIDS和成人白血病等，在初篩試驗陽性后，尚需用WB法進(jìn)行確認(rèn)試驗。病毒的分類和微生物檢驗專家講座第16頁（四）檢測病毒核酸

1．核酸電泳：正粘病毒屬和呼腸病毒屬核酸是分節(jié)段

，甲型流感病毒8個節(jié)段，輪狀病毒11個節(jié)段。從