熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)

熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)第一頁，共十九頁，2022年，8月28日一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^實(shí)驗(yàn)了解熒光原位雜交技術(shù)的基本原理和在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。掌握原位雜交技術(shù)的操作方法，熟練掌握熒光顯微鏡的使用方法。第二頁，共十九頁，2022年，8月28日二、實(shí)驗(yàn)原理FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。第三頁，共十九頁，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)用具及材料

Y染色體探針、人外周血中期染色體細(xì)胞標(biāo)本、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、染色缸、載玻片、NikonE-400、熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200μL移液器、20μL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20。

第四頁，共十九頁，2022年，8月28日四、實(shí)驗(yàn)方法及步驟

第五頁，共十九頁，2022年，8月28日1.探針及標(biāo)本的變性

探針變性：標(biāo)本變性：第六頁，共十九頁，2022年，8月28日2.雜交

DNA探針10μL滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37℃雜交過夜（約15～17h）。

第七頁，共十九頁，2022年，8月28日3.洗脫

第八頁，共十九頁，2022年，8月28日4.雜交信號的放大

第九頁，共十九頁，2022年，8月28日5.封片

可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-70的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。

第十頁，共十九頁，2022年，8月28日6.熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果

先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光。本實(shí)驗(yàn)使用的是Y染色體上的特異序列，因此在男性外周血染色體標(biāo)本的雜交中呈陽性，即使在未分裂的細(xì)胞中，也可以觀察到明顯的雜交信號。照相記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

第十一頁，共十九頁，2022年，8月28日觀察結(jié)果(a)間期細(xì)胞(b)中期細(xì)胞，Y染色體熒光標(biāo)記探針

第十二頁，共十九頁，2022年，8月28日五、作業(yè)及思考題

1.通過實(shí)驗(yàn)總結(jié)熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)的技術(shù)關(guān)鍵。2.實(shí)驗(yàn)中會不會出現(xiàn)假陽性，為什么？

第十三頁，共十九頁，2022年，8月28日第十四頁，共十九頁，2022年，8月28日第十五頁，共十九頁，2022年，8月28日第十六頁，共十九頁，2022年