酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交課件

酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交課件演示文稿當(dāng)前1頁，總共25頁。（優(yōu)選）酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交課件當(dāng)前2頁，總共25頁。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與當(dāng)前3頁，總共25頁。

反式轉(zhuǎn)錄激活因子

結(jié)構(gòu)上是組件式的，即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain，簡稱為BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，簡稱為AD)。

當(dāng)前4頁，總共25頁。

這兩個結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。

當(dāng)前5頁，總共25頁。酵母雙雜交當(dāng)前6頁，總共25頁。酵母雙雜交系統(tǒng)的另一個重要的元件

報道株指經(jīng)改造的、含報道基因(reportergene)的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。

最常用的是酵母細(xì)胞，酵母細(xì)胞作為報道株具有許多優(yōu)點:

〈1〉易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒。

〈2〉具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報道基因。

〈3〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結(jié)合當(dāng)前7頁，總共25頁。根據(jù)這個特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Baitprotein的基因構(gòu)建在同一個表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的BD-Baitprotein融合蛋白。將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在

AD-LIBRARY表達(dá)載體上,在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白。當(dāng)前8頁，總共25頁。當(dāng)前9頁，總共25頁。如果誘餌蛋白和靶蛋白能夠相互作用，那么GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和GAL4激活結(jié)構(gòu)域就會相互作用，從而激活lacZ報道基因的表達(dá)。所以我們可以通過轉(zhuǎn)化的酵母的表型來確定誘餌蛋白和靶蛋白是否有相互作用。

當(dāng)前10頁，總共25頁。

當(dāng)前11頁，總共25頁。這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成ADE、HIS、LEU、TRP，因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因ADE、HIS、LACZ、MEL1，從而通過功能互補和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。將陽性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進(jìn)行測序和分析工作。

當(dāng)前12頁，總共25頁。綜上：酵母雙雜交系統(tǒng)通過兩個雜交蛋白在酵母細(xì)胞中的相互結(jié)合及對報告基因的轉(zhuǎn)錄激活來捕獲新的蛋白質(zhì)，其大致步驟為:

1、視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結(jié)合域融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒。

2、將待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域融合，構(gòu)建成文庫質(zhì)粒。當(dāng)前13頁，總共25頁。3、將這兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞中。4、酵母細(xì)胞中，已分離的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報告基因的轉(zhuǎn)錄；反之，則不能。利用4種報告基因的表達(dá)，便可捕捉到新的蛋白質(zhì)。當(dāng)前14頁，總共25頁。

酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能當(dāng)我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。當(dāng)前15頁，總共25頁。

2、利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用

利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進(jìn)行檢測。

當(dāng)前16頁，總共25頁。

3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響

酵母雙雜交的報告基因能否表達(dá)在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發(fā)現(xiàn)它的病毒RNA復(fù)制與依賴于RNA的RNA聚合酶（NS5）與拓?fù)洚悩?gòu)酶NS3，以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)運受體BETA-importin的相互作用有關(guān)。研究人員通過酵母雙雜交技術(shù)找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應(yīng)的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNA病毒的復(fù)制，從而達(dá)到治療這種疾病的目的。

當(dāng)前17頁，總共25頁。4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖

眾多的蛋白質(zhì)之間在許多重要的生命活動中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的?；蚪M中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達(dá)文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認(rèn)識一些重要的生命活動：如信號傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義當(dāng)前18頁，總共25頁。

在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了

酵母單雜交、酵母三雜交和酵母的反向雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點。當(dāng)前19頁，總共25頁。

酵母單雜交技術(shù)最早是從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來，酵母雙雜交技術(shù)通過對報告基因的表型進(jìn)行檢測以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)間相互作用的研究，而酵母單雜交技術(shù)則通過對報告基因的表型檢測，分析DNA、蛋白之間的相互作用，以研究真核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控。當(dāng)前20頁，總共25頁。

原理用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)；而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨立地發(fā)揮作用。據(jù)此，我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為其他蛋白，只要他能與我們想要了解的目的基因相互作用，就照樣可以通過其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，從而啟動對下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)前21頁，總共25頁。

正是基于這一理論，酵母單雜交系統(tǒng)由2部分組成：(1)將文庫蛋白片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫質(zhì)粒；(2)含有目的基因和下游報告基因的報告質(zhì)粒.

首先將報告質(zhì)粒整合入酵母基因組,產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報告株;

再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入報告株;

若存在文庫蛋白與目的基因的相互作用,可通過對報告基因的表達(dá)將文庫蛋白的基因篩選出來.當(dāng)前22頁，總共25頁。

酵母三雜交系統(tǒng)的原理與酵母雙雜交相似，利用了酵母細(xì)胞的GAL4蛋白調(diào)節(jié)目的基因(半乳糖苷酶基因及His3基因)轉(zhuǎn)錄的特點。GAL4蛋白具有兩個可分離的功能區(qū)，N端是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。只要這兩個相對獨立的結(jié)構(gòu)域能夠通過一定的方式在空間上足夠的靠近(如借助其他分子的相互結(jié)合使其足夠靠近)，即使它們之間沒有共價結(jié)合也可激活轉(zhuǎn)錄，這為研究蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用提供了可能。當(dāng)前23頁，總共25頁。

當(dāng)前24頁，總共25頁。

上圖顯示了酵母三雜交系統(tǒng)的原理。在酵母三雜交系統(tǒng)，lexA啟動子調(diào)控下游LacZ基因和His3基因的表達(dá)，