受體分析檢查檢驗核醫(yī)學(xué)

受體分析檢查檢驗核醫(yī)學(xué)第1頁/共56頁2受體的放射性配體結(jié)合分析

radioligandbindingassayofreceptors,RBA第2頁/共56頁3受體（receptor）是細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)的一些能與生物活性物質(zhì)相互作用并引起特異性生物效應(yīng)的物質(zhì)。受體與其配體（ligand）結(jié)合后，通過受體特定的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，引起細(xì)胞的特定反應(yīng)，是高等動物適應(yīng)環(huán)境、協(xié)調(diào)機體各種細(xì)胞功能的關(guān)鍵性分子。第3頁/共56頁4受體的放射性配體結(jié)合分析（radioligandbindingassayofreceptors，RBA）是用放射性核素標(biāo)記的配體與相應(yīng)的受體進行特異性結(jié)合反應(yīng)，從而對受體進行定性或定量分析。放射性配體+受體分子受體配體復(fù)合物分離B與F測定，計算受體數(shù)量及親和力第4頁/共56頁5定量RBA是在已知配體與受體反應(yīng)的基礎(chǔ)上，通過結(jié)合反應(yīng)得知一定數(shù)量的組織或細(xì)胞與該放射性配體結(jié)合的受體數(shù)量，即結(jié)合位點數(shù)。配體與受體的親和力以結(jié)合反應(yīng)的平衡解離常數(shù)表示。定性RBA則通過反應(yīng)量效關(guān)系、某些參數(shù)的變化等判斷受體的類型、結(jié)合方式（單位點系統(tǒng)或多位點系統(tǒng)）、受體與配體相互作用特點等。第5頁/共56頁6一、RBA的主要優(yōu)點1、高靈敏度2、特異性強、專一性好3、受體制劑的多用性第6頁/共56頁7二、受體的分類膜受體核受體第7頁/共56頁8（一）膜受體由胞膜外、胞膜內(nèi)、跨膜區(qū)組成。按跨膜區(qū)又可分為：1、G蛋白偶聯(lián)受體（神經(jīng)遞質(zhì)、前列腺素等）2、單一跨膜區(qū)有激酶活性受體（細(xì)胞因子）3、單一跨膜區(qū)無激酶活性受體（生長因子、INS）4、離子通道型受體（Na+、K+、Cl-、Ca++等）第8頁/共56頁9第9頁/共56頁102、核受體

受體在細(xì)胞核上，通過與細(xì)胞核內(nèi)特定的DNA結(jié)合后影響遺傳信息的轉(zhuǎn)錄。核受體一般是由400～1,000個氨基酸殘基組成的可溶性單體蛋白質(zhì)。氨基端是高度可變區(qū)，與轉(zhuǎn)錄的特異性有關(guān)。中間是DNA結(jié)合區(qū)，富含半胱氨酸，含有兩個“鋅指”結(jié)構(gòu)，受體通過“鋅指”與DNA結(jié)合；該區(qū)域部位保守性強。羧基端為激素結(jié)合區(qū)。

糖皮質(zhì)激素受體類、性激素受體類、甲狀腺激素受體類。第10頁/共56頁11三、受體與其配基作用的特點1．可飽和性2．可逆性3、特異性和親和力4．生物效應(yīng)的一致性

5.需具有內(nèi)源性配體

第11頁/共56頁121．可飽和性每個細(xì)胞所含的受體數(shù)目有限，故配體與受體的結(jié)合反應(yīng)具有可飽和性，呈高親和力和低容量。2、可逆性配體與受體的結(jié)合是可逆的，當(dāng)受體周圍配體濃度降低，結(jié)合反應(yīng)就逆向進行，即配體與受體解離，解離后的配體是原形，不起代謝變化。第12頁/共56頁133、特異性和親和力受體有特異識別配體的作用，只有嚴(yán)格構(gòu)型和構(gòu)象的配體才能選擇性地與某受體結(jié)合。受體的特異性還表現(xiàn)在器官或組織的專一性。受體的親和力表明其與配體的結(jié)合能力，高親和力說明受體配體結(jié)合牢固。平衡解離常數(shù)在10-9mol/L以上的被認(rèn)為高親和力受體。第13頁/共56頁144．生物效應(yīng)的一致性受體的主要功能是介導(dǎo)配體的生物效應(yīng)，如一種蛋白質(zhì)與某種物質(zhì)結(jié)合而不介導(dǎo)特定生物效應(yīng)，則此蛋白質(zhì)不能稱之為受體。5.需具有內(nèi)源性配體受體都需有內(nèi)源性配體，如果通過外源性配體發(fā)現(xiàn)某種蛋白質(zhì)分子具有類似受體的特性，但未找到內(nèi)源性配體，則稱之為孤兒受體，不能認(rèn)為是真正的受體。第14頁/共56頁15四、單位點系統(tǒng)RBA的基本原理1、簡單單位點系統(tǒng)受體配體相互作用的基本規(guī)律不少受體與配體結(jié)合的系統(tǒng)只存在一種結(jié)合位點，即簡單單位點系統(tǒng)，其基本規(guī)律符合質(zhì)量作用定律。質(zhì)量作用定律第15頁/共56頁16

1=1[R][L]，2=2[RL]平衡時：1[R][L]=2[RL]則平衡解離常數(shù)：

KD=2/1=[R].[L]/[RL]KD是平衡解離常數(shù),為平衡親和常數(shù)KA的倒數(shù)，單位為mol/L，KD越大表示親和力越低。

第16頁/共56頁17設(shè)受體和配體的初始濃度為[RT]和[LT],[R]=[RT-RL]，[L]=[LT-RL]，則：經(jīng)整理后得：

[RL]2—[RL][RT+LT+KD]+[RT][LT]=0

對特定配體和某一固定量的特定受體，[RT]和KD均是定值，于是[RL]僅隨[LT]而變，二者呈雙曲線函數(shù)關(guān)系。第17頁/共56頁182、飽和曲線簡單單位點系統(tǒng)RBA應(yīng)能得到典型的飽和曲線。以[RL]為縱坐標(biāo)，[LT]為橫坐標(biāo)，得到[RL]隨[LT]變化的曲線。配體的濃度從零開始上升時，復(fù)合物濃度先是上升很快，以后逐漸變慢，最后絕大部分受體都與配體結(jié)合，即受體飽和了。此就是飽和曲線。飽和曲線趨向水平則說明大部分受體已與配體結(jié)合。第18頁/共56頁19第19頁/共56頁20（1）總結(jié)合（totalbinding，TB）受體與標(biāo)記配體結(jié)合時，測量得到的放射性還含有一部分（反應(yīng)管壁吸附、雜蛋白吸附、分離不完全等）未與受體結(jié)合的標(biāo)記配體的放射性，需將此部分減去才能得到特異結(jié)合計數(shù)。第20頁/共56頁21（2）非特異結(jié)合

（non-specificbinding，NSB）放射性配體除與受體特異性結(jié)合外，尚可與其他成分結(jié)合，稱之為NSB。主要來自雜蛋白、反應(yīng)器壁、分離材料的吸附等。特點是結(jié)合容量大而親和力小，不會出現(xiàn)飽和現(xiàn)象，結(jié)合量與所使用的配體量呈線性關(guān)系。常做一系列平行管，條件與TB相同，多加200∽1000倍非標(biāo)記配體以取代標(biāo)記配體與受體結(jié)合，測得的即NSB。

第21頁/共56頁22（3）特異結(jié)合

（specificbinding，SB）受體與標(biāo)記配體結(jié)合的放射性計數(shù)，無法直接獲得。常用相同濃度的TB減去NSB求得。第22頁/共56頁23TBSBNSB第23頁/共56頁24五、離體RBA的基本方法

制備待測受體的離體標(biāo)本加放射性配體溫育一定時間終止反應(yīng)、分離結(jié)合與游離部分測定結(jié)合部分的放射性數(shù)據(jù)處理、求出有關(guān)參數(shù)第24頁/共56頁25（一）基本試劑及制備1、受體樣本2、放射標(biāo)記配基3、非標(biāo)記配基第25頁/共56頁261、待測受體標(biāo)本的制備

用于離體RBA的標(biāo)本大體可分為組織切片、完整細(xì)胞懸液、經(jīng)初步分離的細(xì)胞組分及經(jīng)增溶或進一步純化的受體蛋白等。第26頁/共56頁271）組織切片為保持受體活性，常用冷凍組織切片，厚度5～50m，將其貼于涂有明膠的玻片上，在溫育緩沖液中與標(biāo)記配體進行反應(yīng)。反應(yīng)后洗去游離部分?？晒蜗虑衅瑴y量其放射性活度，也可用放射自顯影或免疫組化研究受體分布。第27頁/共56頁282）完整細(xì)胞懸液的制備血細(xì)胞可用通常分離血中有形成分的方法分離。從組織中分離細(xì)胞一般是用膠原酶處理組織，再將游離的細(xì)胞分離出來。用完整細(xì)胞進行RBA的主要優(yōu)點是可同時觀察配體與受體結(jié)合的情況和細(xì)胞的生物效應(yīng)，得到的結(jié)果更能反映受體的生理特性。此外，還可直接給出平均每個細(xì)胞的受體數(shù)目。缺點是在處理過程中有時可能導(dǎo)致細(xì)胞表面生理活性的改變。有時受體在細(xì)胞中的含量很低，則需用較大量的細(xì)胞才能作一次實驗。第28頁/共56頁293）細(xì)胞組分的分離組織勻漿多數(shù)RBA使用細(xì)胞組分進行分析。其優(yōu)點是：①去除了大部分雜蛋白和內(nèi)源性配體，減少NSB或其他因素的干擾；②受體蛋白得到初步濃縮，受體制劑的富集可獲得可靠的實驗結(jié)果。第29頁/共56頁30組織勻漿沉淀：完整細(xì)胞、核受體上清液800～3500×g,10～15min沉淀：線粒體，膜受體上清液10,000～300,000×g,10～15min沉淀：微粒體上清液：漿受體10,000～300,000×g,10～15min第30頁/共56頁312、放射標(biāo)記配基1）高親和力、高特異性2）高穩(wěn)定性3）高比活度4）高放化純第31頁/共56頁323、非標(biāo)記配基用來設(shè)立NSB，可以與標(biāo)記配基同一物質(zhì)，也可不同，但必須與受體結(jié)合有高親和力。第32頁/共56頁33（二）溫育條件1、緩沖液2、時間與溫度

第33頁/共56頁34（三）分離分離的目的是將已形成的放射性復(fù)合物與游離的放射性配體分開，測定其復(fù)合物放射性。一旦分離，原有的反應(yīng)平衡被破壞，因此在分離過程中要使復(fù)合物的解離降低到最低程度，低溫和快速是最有效的措施。常用的分離方法有：1、平衡透析法；2、離心法3、過濾法第34頁/共56頁35六、定量RBA的數(shù)據(jù)處理

定量RBA主要是通過測得的樣品的數(shù)據(jù)及所用標(biāo)記配體的量和比活度，通過數(shù)學(xué)模型進行運算，得出受體的有關(guān)參數(shù)[RT]、KD等。第35頁/共56頁361、單點法僅取一個濃度點的標(biāo)記配體，標(biāo)記配體的量可使受體飽和并略有剩余（過量）。該法操作簡便，標(biāo)本用量少，但只能給出受體的最大結(jié)合位點數(shù)（RT），無法得了該配體與受體的親和力（KD）。第36頁/共56頁37單點法RBA的數(shù)據(jù)處理(1)從實驗所得到的總結(jié)合TB減去非特異性結(jié)合NSB的平均放射性計數(shù)（cpm）得到特異性結(jié)合RL的cpm。(2)根據(jù)儀器測量效率將RL的cpm換算成dpm,用配體的比活度再換算成mol。(3)受體與配體的結(jié)合按1：1形成復(fù)合物，則RL的mol即為受體結(jié)合位點的mol數(shù)。第37頁/共56頁38(4)另取一定量的樣品測蛋白含量或細(xì)胞數(shù)，即可算成一定量蛋白或一定細(xì)胞數(shù)中RT的mol數(shù),即為[RT]。(5)還可進一步將mol換算成分子數(shù)（1mol=6.02×1023個分子），從而得到單位細(xì)胞或單位蛋白的受體結(jié)合位點數(shù)。第38頁/共56頁39此式中受體與配體為1：1關(guān)系，如受體與配體以1：2關(guān)系形成復(fù)合物，則上式應(yīng)被2除。對于完整細(xì)胞，則按細(xì)胞數(shù)進行計算，以mol/106細(xì)胞或受體位點數(shù)/106細(xì)胞表示。

第39頁/共56頁40例實驗室進行外周血WBC的GCR分析，測得TB為4500cpm，NSB為2500cpm，3H-Dex的SA為1.85×1012Bq/mmol，蛋白量為1mg，液閃的Eff=30%SB=TB-NSB=4500-2500=2000cpm2000/（0.3×60×1.85×1012×1）=60fmol/mg第40頁/共56頁411mol=6.02×1023分子60fmol/mg=

60×10-15×6.02×1023=3.6×1010受體/mg蛋白若：WBC細(xì)胞數(shù)為7.5×106個，則[RT]=3.6×1010/7.5×106=4800受體/細(xì)胞第41頁/共56頁422、多點法多點法實驗可分簡單單位點和雙（多）位點兩部分。常用多點飽和曲線法：即每一受體標(biāo)本做6∽8個標(biāo)記配體濃度點（多位點所需濃度點更多），標(biāo)記配體的用量應(yīng)覆蓋受體的飽和區(qū)和不飽和曲，以得到飽和曲線。數(shù)據(jù)處理是將數(shù)學(xué)模型直線化，再將測得數(shù)據(jù)進行直線擬合，求出所需參數(shù)。計算機普及后，人們用計算機進行曲線擬合，以減少直線化帶來的誤差。第42頁/共56頁43Scatchard作圖簡單單位點系統(tǒng)在Scatchard作圖中應(yīng)呈一條直線。以[RL]/[L]對[RL]作圖，即為Scatchard作圖。在簡單單位點系統(tǒng)，應(yīng)得一直線。斜率是-1/KD，而直線與橫軸的交點則等于[RT]值。

第43頁/共56頁44第44頁/共56頁45例：

實驗室做外周血WBC的GCR多點分析，3H-Dex的SA為38.0Ci/mmol，放化純?yōu)?9%，配成工作濃度10uCi/ml.第45頁/共56頁461、加樣程序WBC/GCR3H-Dex多點RBA編號3H-DexDex(ul)PBS補足體積ul細(xì)胞ululnMTB1104.38

90500NSB1104.38585500TB2208.77

80500NSB2TB32510.95

75500NSB32510.9512.562.5500TB43013.16

70500NSB4TB54017.54

60500NSB54017.541540500TB65021.93

50500NSB65021.932525500第46頁/共56頁472、測量結(jié)果WBC/GCR3H-Dex多點RBA測量結(jié)果編號3H-Dex（ul)TB（cpm）NSB（cpm）T(cpm)11017865691445302202799

289060325332213753613254303627

4335905404235211757812065047402690722650第47頁/共56頁483、建立NSB的回歸方程以NSB管的cpm對3H-Dex的體積數(shù)（10、20、25、、3040、50）建立回歸方程，得到：Y=52.5456X+45.7007（r=0.9997）將未做的NSB管對應(yīng)的3H-Dex體積（20、40）代入方程，得到NSB各管值。

（10、571）；（20、1097）；（25、1359）；（30、1622）；（40、2148）；（50、2673）第48頁/共56頁494、計算B、F和B/F3H-Dex（ul)SB（cpm）F（cpm）B/F1012151427440.0085122017022862610.0059462519633580030.0054833020054299630.0046634020875738850.0036375020677179100.002879第49頁/共56頁505、換算B相對應(yīng)的3H-Dex物質(zhì)量

比放=SA為38.0Ci/mmol，放化純?yōu)?9%，Eff=42%1、38Ci/mmol=38uCi/nmol=1.406×106Bq/nmol2、1nmol=1.406×106Bq÷0.99=1.4202×106Bq3、1cpm=1/