地中海貧血的分子基礎(chǔ)及產(chǎn)前診斷徐湘民

遺傳性血紅蛋白病Geneticdisordersofhumanhemoglobin

異常血紅蛋白

Abnormalhemoglobin,Structuralvariants

地中海貧血(地貧)

Thalassemias-thalassemia

-thalassemia

遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白

Hereditarypersistenceoffetalhemoglobin(HPFH)當(dāng)前1頁，總共67頁。Thalassemia地中海貧血是全球最大的單基因遺傳病之一中國南方不同高發(fā)地區(qū)人群攜帶率1

~

23%研究背景當(dāng)前2頁，總共67頁。全球血紅蛋白病人群負(fù)荷WHO地區(qū)人口(百萬)出生(百萬)純合子出生(千)非洲65030.0230美洲73017.55.0亞洲315084.0120.0歐洲78011.01.6大洋洲300.50.2合計5340143.0356.8當(dāng)前3頁，總共67頁。中國南方地中海貧血人群攜帶率

地區(qū)攜帶率(%)

地貧β地貧

廣東8.532.54

廣西14.956.78

四川1.922.18

臺灣4.201.10

香港5.023.41Xu,etal.JClinPathol2004,57:517-22.

Cai,etal.ChiJEpidemiol

2002,23:281-5.

當(dāng)前4頁，總共67頁。排序出生缺陷分析例數(shù)發(fā)生頻率(/萬)1先天性心臟病26019.662重型地貧20815.733多指20015.124肢體短縮1118.395唇裂/腭裂1098.24廣州市主要出生缺陷的發(fā)生率(1998-2001)

當(dāng)前5頁，總共67頁。Pedigreefor-thalassemiainatypicalfamily.地中海貧血:常染色體隱性遺傳病當(dāng)前6頁，總共67頁。地貧是嚴(yán)重致死、致殘性遺傳性血液病常染色體隱性遺傳病受累基因：地貧-珠蛋白基因（16p13.3）

β地貧-β珠蛋白基因（11p15.3）突變純合子：重型地貧-致死

中間型地貧

-致殘病理學(xué)基礎(chǔ)：/β鏈比例失衡當(dāng)前7頁，總共67頁。地貧純合子：致死性出生缺陷重型地貧:胎兒水腫綜合征

早產(chǎn)死胎或出生前后死亡

可導(dǎo)致嚴(yán)重產(chǎn)科并發(fā)癥

無理想治療方法重型地貧

出生后1年內(nèi)發(fā)病

多于未成年前因嚴(yán)重貧血而夭折

輸血和去鐵治療可維持,代價昂貴當(dāng)前8頁，總共67頁。家系樣品采集現(xiàn)場中間型地貧是嚴(yán)重致殘性遺傳病當(dāng)前9頁，總共67頁。研究地中海貧血的意義

重癥地貧患兒的出生是世界公認(rèn)的公共衛(wèi)生問題

通過產(chǎn)前診斷阻止重癥患兒出生是首選預(yù)防措施

WHO優(yōu)先推薦在發(fā)展中國家實施預(yù)防的遺傳性疾病

預(yù)防地貧是中國南方高發(fā)區(qū)減少出生缺陷的戰(zhàn)略需求研究背景當(dāng)前10頁，總共67頁。中國需要解決的研究主題

發(fā)展用于臨床和預(yù)防的分子診斷技術(shù)

高發(fā)地區(qū)人群中的遺傳流行病學(xué)調(diào)查

開展人群水平的地中海貧血預(yù)防當(dāng)前11頁，總共67頁。指導(dǎo)制定計劃大人群監(jiān)控和預(yù)防用于基因分型用于產(chǎn)前診斷

診斷篩查預(yù)防地中海貧血的研究策略研究背景遺傳流行病學(xué)調(diào)查建立一系列診斷標(biāo)準(zhǔn)和診斷技術(shù)當(dāng)前12頁，總共67頁。地中海貧血的臨床特征小細胞低色素性溶血型貧血(中、重度)黃疸肝脾腫大(脾大明顯)骨髓擴增發(fā)育遲緩合并感染Bart’s水腫胎(α地貧,宮內(nèi)或出生后半小時內(nèi)死亡)當(dāng)前13頁，總共67頁。地中海貧血的血液學(xué)表型特征

RBC參數(shù)

MCVMCH

細胞形態(tài)變化

Hb電泳分析

HbA2

()或()HbBart’sHbH()HbE()當(dāng)前14頁，總共67頁。地貧血象：紅細胞著色不足、異形紅細胞和骨髓成紅血細胞增多癥當(dāng)前15頁，總共67頁。血紅蛋白電泳圖譜123451.正常人HB2.輕型地貧3.異常HBE雜合子4.新生兒HBBart’s(地貧標(biāo)準(zhǔn)型）5.HBHNormalAA2AEBart’sAFHA+-500V,25min當(dāng)前16頁，總共67頁。地貧發(fā)生的分子病理學(xué)經(jīng)典機制

α地貧:基因缺失使基因功能丟失地貧:結(jié)構(gòu)基因變異使轉(zhuǎn)錄異常當(dāng)前17頁，總共67頁。

-50kb-10kb0kb10kb20kb30kb

(--SEA)Deletion(-

4.2)Deletion(-

3.7)Deletion21導(dǎo)致α地貧的不同類型的基因缺失當(dāng)前18頁，總共67頁。α

GlobingenesaffectedbythalassemiadeletionSilentcarrierThalassemiatraitHbHdiseaseHydropsfetalisNormal當(dāng)前19頁，總共67頁。α地貧疾病嚴(yán)重程度的單倍型順序21T

2–

–1

2T1

–1T

––當(dāng)前20頁，總共67頁。Hematologicaldataoftheproposituseandherfamilymembers.

Ι1Ι2Ⅱ1Ⅱ2Ⅱ3Ⅱ4Ⅱ5Ⅲ1Ⅲ2Sex/age(Y)F/49M/54M/33F/27F/25M/22F/35F/1M/5Hb(g/L)118150173126135135118112141RBC(×1012)5.634.965.706.234.514.575.876.095.02MCV(fL)64.585.788.162.187.882.363.056.278.5MCH(pg)21.030.230.420.229.929.520.118.428.1HbA(%)97.897.593.197.096.695.796.990.097.4HbA2(%)2.202.503.272.983.373.283.122.182.65HbF(%)003.6200007.790Genotype--11.1/ααΑα/ααΑα/αα--11.1/ααΑα/ααΑα/αα--11.1/αα--11.1/ααΑα/αα當(dāng)前21頁，總共67頁。JiaSQ,etal.JClinPathol,2004;57:164-7.

當(dāng)前22頁，總共67頁。DifferentpointmutationsreducingglobingeneexpressionEXON1IVS1

EXON2EXON3

IVS2PromotermutationRNAsplicingInitiationmutationFrameshiftNonsensePoly(A)signalRund.&Rachmilewitz.N.Engl.J.Med.

2005,353:1135-46.

當(dāng)前23頁，總共67頁。世界上不同種族的常見β地貧突變類型

種族突變類型

地中海人

IVS-1,position110(GA)CD39,nonsense(CAGTAG)IVS-1,position1(GA)IVS-2,position745(CG)IVS-1,position6(TC)IVS-2,position1(GA)黑人

29,(AG);88,(CT)Poly(A),(AATAAAAACAAA)當(dāng)前24頁，總共67頁。東南亞人,中國人

CD41-42,Frameshift(CTTT)IVS-2,position654(CT)

28,(AG);HbE(GA)CD17,nonsense(AAGTAG)IVS-1,position5(GC)亞洲印地安人

IVS-1,position5(GC)619-bpdeletionCD8-9,Frameshift(+G)IVS-1,position1(GT)CD41-42,Frameshift(CTTT)當(dāng)前25頁，總共67頁。SexProbandfemale

Motherfemale

Father

maleBrothermale

Husband

maleRBC(x1012)5.7

4.84.75.86.4Hb(g/L)

139

105154144145MCV(fl)

73.6

68.288.273.467.1MCH(pg)23.6

21.833.024.722.8MCHC(g/L)

357

320374336340RDW(%)

0.149

0.1520.1320.1440.159HbA(%)

94.3

93.697.294.097.1HbA2(%)

5.7

6.42.86.02.9Genotype

β-90/βN

β-90/βNβN/βNβ-90/βNβN/βNβ/αratio

2.130

2.2193.7162.2385.341Resultsofbloodanalysis,DNAdiagnosisandmRNAdetectioninthefamilymembers.當(dāng)前26頁，總共67頁。Sequencingofthe-globingeneamplifiedfromtheprobandHeterozygosityfortheCTsubstitutionatposition-90oftheβ-globingene當(dāng)前27頁，總共67頁。近年來發(fā)現(xiàn)的部分中國南方新突變基因

突變α珠蛋白基因11.1大片段缺失α珠蛋白基因

2CD118(+TCA)β珠蛋白基因

90(C→T)β珠蛋白基因73(A→T)β珠蛋白基因28(A→C)β珠蛋白基因

CDs15/16(+G)β珠蛋白基因CD38(A)當(dāng)前28頁，總共67頁。地中海貧血的產(chǎn)前診斷

胎兒取樣技術(shù)

DNA診斷技術(shù)

-地貧的診斷-地貧的診斷當(dāng)前29頁，總共67頁。羊膜穿刺(amniocentesis)

抽取胎兒樣品示意圖當(dāng)前30頁，總共67頁。植入前基因診斷

Preimplantationgeneticdiagnosis(PGD)超聲產(chǎn)前診斷

Prenataldiagnosis:Ultrasoundmeasurement

母體外周血分離胎兒細胞進行產(chǎn)前診斷

Prenataldiagnosis:Fetalcellsinthematernalcirculation母體血漿或血清中胎兒DNA分析

AnalysisoffetalDNAinmaternalplasmaandserum目前及今后的胎兒產(chǎn)前診斷新技術(shù)當(dāng)前31頁，總共67頁。DingC,ChiuRW,LauTK,LeungTN,ChanLC,ChanAY,CharoenkwanP,NgIS,LawHY,MaES,XuX,WanapirakC,SanguansermsriT,LiaoC,AiMA,ChuiDH,CantorCR,LoYM.

MSanalysisofsingle-nucleotidedifferencesincirculatingnucleicacids:Applicationtononinvasiveprenataldiagnosis.

ProcNatlAcadSciUSA.200420;101(29):10762-7.當(dāng)前32頁，總共67頁。單堿基延伸產(chǎn)物的質(zhì)譜分析MFF父親的突變類型SABER:singleallelebaseextensionreaction當(dāng)前33頁，總共67頁。分子量FMStandardprotocol

SABERprotocol在母血漿DNA中排除父親的β地貧突變——++雙親基因型不同：當(dāng)前34頁，總共67頁。CaseCD41/42-CTTTIVS2654CTnt–28AGCD17ATStandardprotocolSABERFetalgenotypeWeeksgestation1FMN/N112FMN/N183F

MN/N214MFF

/N185MF

F

/M176FM

F/N117FM

F/N148FN/N79

FF/N1210MF

N/N1711F

F/N2012M&FN.A.N.A.N/N18鑒定母血漿DNA中的父親β地貧突變當(dāng)前35頁，總共67頁。單倍型分析用于鑒定母血漿DNA中的父親等位基因CaseMotherFatherHBBmutantalleleHBBWTalleleSNPGallelePaternalHBBmutationFetalHBBgenotype3CCGCGC

N/N11CCGCGC

F/N12CCGCGC

N.A.N/N當(dāng)前36頁，總共67頁。地中海貧血的產(chǎn)前診斷

胎兒取樣技術(shù)

DNA診斷技術(shù)

-地貧的診斷-地貧的診斷當(dāng)前37頁，總共67頁。DNA診斷技術(shù)多重PCR（multiplexPCR）等位基因特異性性寡核苷酸雜交（ASO）反向點雜交（RDB）變性高效液相色譜（DHPLC）基于微孔板

(microtiterwell-based)高通量檢測

實時PCR(real-timePCR)當(dāng)前38頁，總共67頁。

-50kb-10kb0kb10kb20kb30kb

(--SEA)Deletion(-

4.2)Deletion(-

3.7)Deletion21導(dǎo)致α地貧的不同類型的基因缺失當(dāng)前39頁，總共67頁。Locationofprimersanddetectionof--SEAdeletionbygap-PCR當(dāng)前40頁，總共67頁。Genotypingofthe--SEAallelesbyGap-PCR

當(dāng)前41頁，總共67頁。ChongSS,etal.Blood.2000;95(1):360-2.當(dāng)前42頁，總共67頁。寡核苷酸探針雜交技術(shù)當(dāng)前43頁，總共67頁。ASO探針檢測

-地貧基因診斷結(jié)果當(dāng)前44頁，總共67頁。PCRBBBBBBgDNAHybridizationDetectionStreptavidin-PODColorSignalMMembraneASONMNMNMSubstrate(TMB)反向點雜交技術(shù)當(dāng)前45頁，總共67頁。RDBanalysis:applicationtorapidprenataldiagnosisforeightβthalassaemiamutations.GenotypeFatherCDs41-42(CTTT)/NMotherIVS-2-654(CT)/NFetusCDs41-42/IVS-2-654Normalcontrol

N/N當(dāng)前46頁，總共67頁。Human-globingeneandthePCRamplicons5’UTREXON1IVS1EXON2IVS2IVS2EXON33’UTRFA(453bp)FB(364bp)FC(423bp)-90,-73,-29,-28cd2cd13-14,cd14-15,cd15-16,cd17cd26,cd27-28IVS1-1,IVS1-5cd37,cd38cd41-42,cd43cd71-72IVS2-5,IVS2-16IVS2-654,IVS2-666當(dāng)前47頁，總共67頁。FragmentMutationpatternsNormalpatternsTotalMutationMutation+SNPHeterozygousHomozygousFA12221237FB5152224FC03227Total1740566868uniquelyprofiledDHPLCpatternsobservedfrom795DNAsamples當(dāng)前48頁，總共67頁。實驗結(jié)果當(dāng)前49頁，總共67頁。實驗結(jié)果當(dāng)前50頁，總共67頁。實驗結(jié)果當(dāng)前51頁，總共67頁。實驗結(jié)果當(dāng)前52頁，總共67頁。實驗結(jié)果當(dāng)前53頁，總共67頁。中國南方和β地中海貧血的預(yù)防計劃人群篩查預(yù)防計劃的策略

醫(yī)院水平(Hospital-based)的預(yù)防計劃

社區(qū)水平(community-based)的預(yù)防計劃

家系擴展篩查(screeningextendedfamilies)當(dāng)前54頁，總共67頁。Carrierscreeningforandthalassemiainpregnancy:theresultsofan11-yearprospectiveprograminGuangzhouMaternalandNeonatalHospitalGuangzhouMaternalandNeonatalHospitalLiaoCLiJHuangYNLiQMFengQZhongHZCuiYYSouthernMedicalUniversityMoQHLiLYHuaLZhangJZZengRJiaSQXuXMPrenatDiagn2004,25:163-71當(dāng)前55頁，總共67頁。地貧攜帶者篩查及產(chǎn)前診斷流程被檢對象（婚前或孕中期）血液學(xué)分析（MCV，HbA2變化）排除地貧地貧攜帶者遺傳咨詢，配偶檢查血液學(xué)分析（MCVHbA2變化）地貧攜帶者排除地貧遺傳咨詢雙親基因分析胎兒產(chǎn)前診斷當(dāng)前56頁，總共67頁。年份篩查廣州總篩查孕婦數(shù)孕婦數(shù)丈夫數(shù)

篩查發(fā)現(xiàn)的檢測出的完成的產(chǎn)前陽性孕婦數(shù)陽性夫婦數(shù)診斷數(shù)α地貧

(%)β地貧(%)α地貧(%)β地貧(%)α/β地貧(%)α地貧(%)β地貧(%)1993398968393350232(5.8)129(3.2)13(3.7)8(2.3)10(2.9)12(92.3)7(87.5)1994456471617421265(5.8)164(3.6)18(4.3)8(1.9)9(2.1)16(88.9)8(100)1995390271751361227(5.8)142(3.6)17(4.7)7(1.9)12(3.3)15(88.2)7(100)1996499474460464285(5.7)181(3.6)19(4.1)8(1.7)12(2.6)17(89.5)8(100)1997439271989401250(5.7)158(3.6)21(5.2)7(1.7)10(2.5)18(85.7)7(100)1998453275378425263(5.8)172(3.8)17(4.0)8(1.9)12(2.8)17(100)8(100)1999501680141465285(5.7)186(3.7)24(5.2)8(1.7)14(3.0)23(95.8)8(100)OutcomesofscreeningprograminGZMNH1993-2003

當(dāng)前57頁，總共67頁。年份篩查廣州總篩查孕婦數(shù)孕婦數(shù)丈夫數(shù)

篩查發(fā)現(xiàn)的檢測出的完成的產(chǎn)前陽性孕婦數(shù)陽性夫婦數(shù)診斷數(shù)α地貧

(%)β地貧(%)α地貧(%)β地貧(%)α/β地貧(%)α地貧(%)β地貧(%)2000449281817418256(5.7)172(3.8)21(5.0)7(1.7)16(3.8)21(100)7(100)2001452180152411254(5.6)164(3.6)17(4.1)8(1.9)12(2.9)17(100)8(100)2002469580667415260(5.6)163(3.4)16(3.9)8(1.9)11(2.7)16(100)8(100)2003412486393372227(5.5)152(3.6)15(4.0)6(1.6)13(3.5)15(100)6(100)Total49221

860758

4503

2804(5.7)

1783(3.6)

198(4.4)

83(1.8)

131(2.9)

187(95.8)

82(98.8)

(cont’d)當(dāng)前58頁，總共67頁。診斷結(jié)果基因型例數(shù)正常

30雜合子(total)35CDs41-42(TCTT)/N14IVS-2-654(C>T)/N8-28(A>G)/N5CD17(A>T)/N3CD26(G>A)/N2-29(A>G)/N1CDs27-28(+C)/N1Unknown/NorNormal1Prenataldiagnosisin83fetusesat-riskforthalassemia當(dāng)前59頁，總共67頁。診斷結(jié)果基因型例數(shù)純合子或雙重雜合子(總數(shù))18CDs41-42(TCTT)/IVS-2-654(C>T)6CDs41-42(TCTT)/-28(A>G)4CDs41-42(TCTT)/CD17(A>T)2IVS-2-654(C>T)/CD17(A>T)2CDs41-42(TCTT)/CDs41-42(TCTT)1CDs41-42(TCTT)/CDs27-28(+C)1IVS-2-654(C>T)/CDs71-72(+A)1IVS-2-654(C>T)/CD43(G>T)1總數(shù)83(cont’d)當(dāng)前60頁，總共67頁。胎兒診斷

產(chǎn)前診斷例數(shù)

α地貧β地貧

總數(shù)

(%)

正常413069(25.6)攜帶者9235125(46.3)受累胎兒*541872(26.7)胎兒流產(chǎn)213