質(zhì)粒提取及酶切鑒定課件

實(shí)驗(yàn)一

質(zhì)粒提取及酶切鑒定P158

基因工程（geneticengineering）是指采用人工方法將不同來(lái)源的DNA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過(guò)程。相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)目的基因工具酶載體基因工程相關(guān)物質(zhì)

質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn)

能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀限制性核酸內(nèi)切酶：

------基因工程的手術(shù)刀是分子生物學(xué)研究中的一種工具酶，能識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶。如：EcoRⅠ和HindⅢ的識(shí)別序列和切口是：

EcoRⅠ：G↓AATTC

HindⅢ：A↓AGCTT概念與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)（restriction-modificationsystem），限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。作用（1）識(shí)別及切割位點(diǎn)相同（2）識(shí)別序列通常為4～8bp的回文結(jié)構(gòu)；（3）切割可產(chǎn)生兩類(lèi)切口，三種末端。

Ⅱ型限制酶特點(diǎn)Ⅱ型酶識(shí)別序列特點(diǎn)—

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口鈍性末端粘性末端掌握質(zhì)粒DNA提取的原理與方法

了解DNA限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定原理

質(zhì)粒提取原理質(zhì)粒的提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異：在堿性環(huán)境中，線性的大分子細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)；溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecylsulfate,SDS）可使細(xì)胞壁裂解。細(xì)菌經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑（SDS）處理后，細(xì)菌DNA纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上，離心時(shí)易被沉淀出來(lái)，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中。再經(jīng)酒精沉淀、洗滌處理，可得到質(zhì)粒DNA。由于操作原因，提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：線形、開(kāi)環(huán)、閉環(huán)超螺旋。與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物（Marker）比較能大概判斷未知DNA的分子量質(zhì)粒DNA為環(huán)狀，在酶切徹底的情況下，DNA片段數(shù)與酶切位點(diǎn)數(shù)目相同質(zhì)粒DNA酶切鑒定的原理Marker質(zhì)粒DNA過(guò)夜酶切（2）取1.5mL離心管一支，加入1.4mL菌液，13000r/min離心1min去掉上清液。加入150μL的溶液Ⅰ，充分混懸細(xì)菌，在室溫下放置10min。（3）加入200μL新配制的溶液Ⅱ。加蓋，顛倒5次使之混勻。冰上放置5min。（4）加150μL預(yù)冷的溶液Ⅲ，加蓋后顛倒5次混勻，冰上放置15min。13000r/min離心5min，取400μL上清液移入另一離心管中。（5）向上清液中加入等體積苯酚/氯仿，震蕩混勻，13000r/min離心2min，300μL上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。（6）向上清液中加入等體積無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置2min。離心5min，倒去上清乙醇溶液，將離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。（7）加入1mL70%乙醇，震蕩并離心，13000r/min離心2min，倒去上清液，晾干，加入20μL的TE緩沖液，使DNA完全溶解，待用。2.質(zhì)粒DNA的酶切鑒定取一只1.5mLEP