基因工程基因工程的工具酶

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:glzhou@:448953745基因工程

GeneticEngineering1當(dāng)前1頁，總共165頁。Office:Room409ofExperimentBuildingNo.3

:06358230050,

:glzhou@:448953745第2章基因工程的工具酶2當(dāng)前2頁，總共165頁。Enzymesinvolvedingeneticengineering1.Restrictionenzymes-cuttingDNA（切割）基因工程中常用的三大類工具酶分別與DNA的切割、修飾、連接有關(guān)。2.DNAmodifyingenzymes

（修飾）3.DNAligase-joiningDNA（連接）Nucleases（核酸酶）Polymerases（聚合酶）EnzymesthatmodifytheendsofDNAmolecules

（末端修飾酶）當(dāng)前3頁，總共165頁。基因工程中常用的三大類酶分別與DNA的修飾、切割、連接有關(guān)。當(dāng)前4頁，總共165頁。Contents1.限制性核酸內(nèi)切酶2.DNA修飾酶3.DNA連接酶當(dāng)前5頁，總共165頁。重點(diǎn)與難點(diǎn)內(nèi)容各種工具酶概念及其基本性質(zhì)各種工具酶在基因工程中的應(yīng)用限制酶與修飾酶重點(diǎn)基因工程工具酶的應(yīng)用難點(diǎn)當(dāng)前6頁，總共165頁。1.Restrictionendonuclease（限制性核酸內(nèi)切酶）一類能識(shí)別dsDNA分子內(nèi)部的特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸酶來源：主要從原核生物中分離純化而來II型核酸內(nèi)切酶：2300種以上，可識(shí)別230種不同的DNA序列（1994年，美國，分子生物學(xué)百科全書）目前發(fā)現(xiàn)有限制性內(nèi)切酶的生物主要是細(xì)菌，少數(shù)霉菌和藍(lán)藻。Todate,over10000microbesfromaroundtheworldhavebeenscreenedforrestrictionenzymes.Fromthese,over3000enzymeshavebeenfoundrepresentingapproximately200differentsequencespecificities.*當(dāng)前7頁，總共165頁。Discoverofrestractionendonulease這種大自然賦予基因工程學(xué)家的了不起的禮物是如何發(fā)現(xiàn)的呢?當(dāng)前8頁，總共165頁。1.1寄主控制的限制與修飾限制

（Host-controlledrestrictionandmodification）大多數(shù)的細(xì)菌對于噬菌體的感染都存在這一些功能性障礙。如：目前尚未發(fā)現(xiàn)有任何一種既可感染假單胞菌又可感染大腸桿菌的噬菌體，且非寄主細(xì)菌的RNA聚合酶不能夠識(shí)別“外源”噬菌體的啟動(dòng)子，即使噬菌體的吸附和轉(zhuǎn)錄能進(jìn)行，也仍然存在這一功能障礙——即為寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象——吳乃虎，基因工程（第二版，上冊），P122*當(dāng)前9頁，總共165頁。1.1寄主控制的限制與修飾限制

（Host-controlledrestrictionandmodification）瑞士學(xué)者W.Arber1952年發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，1978年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。WernerArber*這種現(xiàn)象類似于人體的免疫系統(tǒng)，它可辨別自身的DNA和外來的DNA，并使后者降解——它是限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)。當(dāng)前10頁，總共165頁。PhenomenonKλ（B）λ（K）λ（B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長的λ噬菌體第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生長受寄主限制Kλ（K）存活下來的噬菌體再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制為什么呢？當(dāng)前11頁，總共165頁。說明K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)可排除外來的DNA；10-4的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果

EOP:Efficiencyofplating(生長在不同寄主中的λ噬菌體的成斑率，表示限制程度)。當(dāng)前12頁，總共165頁。當(dāng)前13頁，總共165頁。Whatisthereason研究發(fā)現(xiàn)：原來是由兩種酶配合完成，一種是起修飾作用的甲基化酶，另一種是核酸內(nèi)切酶（1962年）？甲基化酶：能使自身的內(nèi)切酶識(shí)別序列的堿基發(fā)生甲基化，從而使自身DNA免受內(nèi)切酶切割而降解——細(xì)菌的“防御”系統(tǒng)（盾）核酸內(nèi)切酶：識(shí)別并切割酶解外源DNA（外來核酸在內(nèi)切酶識(shí)別序列上沒有甲基化修飾作保護(hù)）（矛）限制一修飾體系：其功能就是保護(hù)自身的DNA，分解外來的DNA當(dāng)前14頁，總共165頁。用這兩種酶來解釋：

Host-controlledrestrictionandmodification再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制（因?yàn)榫甑募谆敢呀?jīng)對其進(jìn)行了修飾，加以保護(hù)）λ（B）噬菌體感染大腸桿菌K菌株后，形成的嗜菌斑非常少（因?yàn)槠銬NA大部分被胞內(nèi)的內(nèi)切酶降解了，但有極少部分能在特定序列甲基化，避免被酶解，因此有少量噬菌斑形成。）*Kλ（B）λ（K）Kλ（K）當(dāng)前15頁，總共165頁。是指一定類型的細(xì)菌可以通過限制性內(nèi)切酶的作用，降解入侵的外源DNA(如噬菌體DNA等)，使得外源DNA對生物細(xì)胞的入侵受到限制。*限制作用當(dāng)前16頁，總共165頁。是指生物細(xì)胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通過甲基化酶的修飾，免遭自身限制性酶的破壞。限制一修飾體系，其功能就是保護(hù)自身的DNA，分解外來的DNA，以保護(hù)和維持自身遺傳信息的穩(wěn)定，這對細(xì)菌的生存和繁衍具有重要意義。*修飾作用當(dāng)前17頁，總共165頁。1.2限制性內(nèi)切酶的類型

Typesofrestrictionandmodification(R-M)systemTypeI(1%):種類少TypeII:98%TypeIII:(<1%)I型和III型:通常都是大型的多亞基的蛋白復(fù)合物，既有內(nèi)切酶的活性，又有甲基化酶活性。輔助因子也較多，除了鎂離子外，還需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM），這樣才能表現(xiàn)出正常的限制活性。當(dāng)前18頁，總共165頁。TypeIRE識(shí)別位點(diǎn)：未甲基化修飾的15bp左右特異序列，非對稱性。酶切位點(diǎn)：在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約1000—1500bp處隨機(jī)切開一條單鏈當(dāng)前19頁，總共165頁。作用機(jī)理：需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。I型限制性內(nèi)切酶具有極強(qiáng)的ATPase的活性，每打開一個(gè)磷酸二脂鍵就需要消耗1000個(gè)分子的ATP。因酶切位點(diǎn)不特異，在基因工程中無意義【★】

。當(dāng)前20頁，總共165頁。TypeIII

REIII型限制性內(nèi)切酶兼有限制-修飾兩種功能，可以特異地識(shí)別DNA，但酶切位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)下游5～15bp的地方。輔酶：ATP和Mg2+在基因工程的意義？？當(dāng)前21頁，總共165頁。TypeIIRE：基因工程中重要的工具酶！！精彩馬上開始！當(dāng)前22頁，總共165頁。（一）TypeIIRE：限制性內(nèi)切酶的性質(zhì)特征1.Recognitionsequencessize：4-8bp，多數(shù)6bp*2.結(jié)構(gòu)特征：rotationalsymmetry-“palindromes”（旋轉(zhuǎn)對稱的回文結(jié)構(gòu)）3.切割后產(chǎn)生的末端：CohesiveterminusorBluntend（粘性末端或平末端）當(dāng)前23頁，總共165頁。例1：EcoRI的識(shí)別序列回文序列：指在雙鏈DNA序列中按確定的方向閱讀，雙鏈中的每一條鏈的序列都是相同的。Recognitionsequence(識(shí)別序列)當(dāng)前24頁，總共165頁。簡并識(shí)別序列有些酶的識(shí)別序列不是一個(gè)，而是多個(gè)。在基因重組時(shí)要盡量少用這些酶例2：當(dāng)前25頁，總共165頁。Cuttingsite（切割位點(diǎn)）切割位點(diǎn)多數(shù)在識(shí)別序列的內(nèi)部，少數(shù)在兩端，部分在兩翼。部分在兩翼少數(shù)兩側(cè)/端多數(shù)在內(nèi)部當(dāng)前26頁，總共165頁。當(dāng)前27頁，總共165頁。Sitepreference（偏愛位點(diǎn)）CertainrestrictionendonucleasesshowpreferentialcleavageofsomesitesinthesameDNAmolecule.相同的DNA分子，有些限制性內(nèi)切酶會(huì)對一些位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛性的切割。這些位點(diǎn)就是限制性內(nèi)切酶的偏愛位點(diǎn)。切割位點(diǎn)兩側(cè)序列的核苷酸組成與切割效率有關(guān)，即某些限制酶對同一介質(zhì)中的有些位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛性切割。*當(dāng)前28頁，總共165頁。Sitepreference（偏愛位點(diǎn)）原因1.邊界堿基的輔助識(shí)別：與識(shí)別序列鄰近的特異性邊界堿基可以提高酶切速度，對酶的識(shí)別起到輔助作用。2.甲基化：限制酶識(shí)別序列內(nèi)或其附近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，會(huì)阻礙限制酶的活性。（限制與修飾現(xiàn)象。受甲基化影響的酶在商品說明書中都會(huì)有標(biāo)示。）3.底物的構(gòu)象：DNA分子的不同構(gòu)型對限制酶的活性也有很大影響。有些酶切割超螺旋DNA和線狀DNA時(shí)會(huì)表現(xiàn)出差異。*當(dāng)前29頁，總共165頁。Cohesiveterminusandbluntend（粘性或平末端）1.Cohesiveterminus(end)(粘性末端）：在對稱軸5’側(cè)或3’切割底物,使得DNA雙鏈交錯(cuò)斷開，產(chǎn)生具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對而重新環(huán)化起來。*2.Bluntorflushend(平端)：在對稱軸上同時(shí)切割DNA的兩條鏈，產(chǎn)生的末端平整，不易于重新環(huán)化。3.非互補(bǔ)的粘性末端：酶切位點(diǎn)在識(shí)別序列之外的。當(dāng)前30頁，總共165頁。①5’粘性末端(protruding5'ends)當(dāng)前31頁，總共165頁。②3’粘性末端(protruding3'ends)當(dāng)前32頁，總共165頁。③平末端（BluntEnd）當(dāng)前33頁，總共165頁。④非互補(bǔ)的粘性末端當(dāng)前34頁，總共165頁。粘性末端的意義或者在基因工程中的作用①連接便利a)不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。這比連接兩個(gè)平末端要容易的多。b)同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。當(dāng)前35頁，總共165頁。②末端標(biāo)記a)凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記?；蛘哂肈NA聚合酶補(bǔ)平5’粘性末端來標(biāo)記。b)凸出的3’末端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端或標(biāo)記。③補(bǔ)平或削平成平末端5’粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平末端。3’粘性末端可以用T4DNAPol或S1酶削平成平末端。當(dāng)前36頁，總共165頁。（二）TypeIIRE：稀切酶、同裂酶與同尾酶稀切酶（rarecuttingenzymes）在DNA分子中出現(xiàn)的幾率低，故稱之為稀切酶。識(shí)別序列比較長；富含AT或富含GC。當(dāng)前37頁，總共165頁。同裂酶(Isoschizomer)【★】

來源不同的II型限制性內(nèi)切酶，具有相同的識(shí)別序列時(shí)，稱為同裂酶(Isoschizomer)。有2種情況：①酶切以后的殘端完全相同：②酶切以后的殘端不同：當(dāng)前38頁，總共165頁。同尾酶(Isocandamers)【★】

來源不同，識(shí)別序列也各不相同，但酶切以后的殘端相同，這種情況稱為同尾酶(Isocandamers).由同尾酶所產(chǎn)生的DNA片段可通過粘性末端之間的互補(bǔ)作用而連接。在基因克隆中很有用！當(dāng)前39頁，總共165頁。同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后開成的新位點(diǎn)一般不能在被原來的酶識(shí)別,WHY？Q：你能推斷出這兩個(gè)酶的識(shí)別序列嗎？I當(dāng)前40頁，總共165頁。Qize用限制酶將Sau3AI(↓GATC)切割的DNA與經(jīng)BamHI(G↓GATCC)切割的DNA連接起來后，能夠被BamHI切割的幾率有多少？當(dāng)前41頁，總共165頁。（三）TypeIIRE：切點(diǎn)在DNA上出現(xiàn)的頻率II型限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)在DNA上出現(xiàn)的頻率受DNA的長度、識(shí)別位點(diǎn)的長度以及GC含量的影響。4bp的識(shí)別位點(diǎn)：1/44＝256bp如：HaeIIIGGCC6bp的識(shí)別位點(diǎn)：1/46＝4096bp如EcoRIGAATTC當(dāng)前42頁，總共165頁。（四）TypeIIRE：甲基化對活性的影響大多數(shù)大腸桿菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一個(gè)胞嘧啶C-5位置上引入甲基。部分限制性內(nèi)切酶對甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等。而要解除這種限制修飾作用通常有兩種方法：當(dāng)前43頁，總共165頁。①選用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA識(shí)別切割位點(diǎn)與MboI相同，但不受甲基化影響；②利用甲基化酶缺失的受體細(xì)胞進(jìn)行DNA的制備，如E.coliJM110和鏈霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而后者細(xì)胞內(nèi)本就沒有甲基化酶，從這些細(xì)胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。當(dāng)前44頁，總共165頁。（五）TypeIIRE：對單鏈DNA的活性對單鏈DNA沒有作用，但局部有雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)可以特異性地切斷。DNA和RNA的雜交產(chǎn)物也是雙鏈結(jié)構(gòu)。可以切斷。當(dāng)前45頁，總共165頁。（五）TypeIIRE：對寡核苷酸的活性盡管是雙鏈、有識(shí)別位點(diǎn)，但因?yàn)樘?，酶不能與DNA有效結(jié)合，所以不能切割。當(dāng)2個(gè)酶切位點(diǎn)距離非常近的時(shí)候，它們之間由于競爭結(jié)合位點(diǎn)，所以也會(huì)相互干擾。當(dāng)前46頁，總共165頁。（六）TypeIIRE：Nomenclature(命名法)Thespeciesnameofthehostorganismisidentifiedbythefirstletterofthegenusnameandthefirsttwolettersofthespecificepithet

togenerateathree-letterabbreviation.Thisabbreviationisalwayswritteninitalics（屬名的第一個(gè)字母+種名的頭兩個(gè)字母，拉丁文）.Whereaparticularstrainhasbeenthesourcethenthisisidentified.（菌株型號(hào)）WhenaparticularhoststrainhasseveraldifferentR-Msystems,theseareidentifiedbyromannumerals（在這個(gè)宿主中發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶的順序，羅馬數(shù)字）.*當(dāng)前47頁，總共165頁。注意：前三個(gè)字母一定要用斜體，各字之間沒有空格！當(dāng)前48頁，總共165頁。（七）TypeIIRE：reactivesystem（反應(yīng)系統(tǒng)）Substrate(底物)：純，線性，有保護(hù)序列Enzyme(酶)：樣品，識(shí)別序列的密度，容積活性Buffer(反應(yīng)緩沖液)。DNA（2ug/ul）5ul10X反應(yīng)液5ul酶（5ug/ul）5ulddH2O

35ul總體積50μL37℃保溫2-3小時(shí)（時(shí)間不定）當(dāng)前49頁，總共165頁。Substrate（底物）1）DNA純度：要求較純因素：蛋白質(zhì)、乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿以及某些高濃度金屬離子措施：增加酶的用量；擴(kuò)大反應(yīng)系統(tǒng)體積;延長反應(yīng)時(shí)間；添加亞精胺*當(dāng)前50頁，總共165頁。Substrate（底物）核酸限制性內(nèi)切酶是原核生物限制—修飾體系的組成部分，因此識(shí)別序列中特定核苷酸的甲基化作用，便會(huì)強(qiáng)烈地影響酶的活性。為避免產(chǎn)生這樣的問題，在基因克隆中，所用的載體（質(zhì)粒DNA）是來源于甲基化酶缺陷型的大腸桿菌菌株。

這樣制備的質(zhì)粒DNA，其中的內(nèi)切酶識(shí)別序列沒有甲基化，不受限制。*2)DNA的甲基化程度：不能有甲基化someorallofthesitesforarestrictionendonucleasemayberesistanttocleavagewhenisolatedfromstrainsexpressingtheDcmorDammethylases.

themodificationstateofplasmidDNAcanaffectthefrequencyoftransformationinspecialsituations.

當(dāng)前51頁，總共165頁。3）DNA分子構(gòu)型

效率：線性DNA分子>超螺旋質(zhì)粒DNA\環(huán)狀病毒DNA當(dāng)前52頁，總共165頁。4）識(shí)別序列的側(cè)面序列

限制酶切割DNA，對識(shí)別序列兩側(cè)的非識(shí)別序列有長度要求，只含識(shí)別序列的寡核苷酸其酶切效率很低，故PCR擴(kuò)增目的序列時(shí)通常要在識(shí)別序列兩側(cè)多加若干個(gè)核苷酸，以便擴(kuò)增后的序列方便切割（例：見下圖）*當(dāng)前53頁，總共165頁。Incorporationofextrasequenceatthe5’endofaprimer.Twoprimershavesequencesdesignedtohybridizeattheendsofthetargetregion.Primer1hasanextrasequencenearits5’endwhichformsaHindIIIsite(AAGCTT),andprimer2hasanextrasequencenearits5’endwhichformsanEcoRI(GAATTC)site.Eachprimerhasanadditional5’-terminalsequenceoffournucleotidessothatthehexanucleotiderestrictionsitesareplacedwithintheextremeendsoftheamplifiedDNA,andsopresentgoodsubstratesforendonucleasecleavage.當(dāng)前54頁，總共165頁。小提示：試劑公司提供的包裝說明書會(huì)標(biāo)明酶活性單位數(shù)和容積活性，最佳作用條件內(nèi)切酶決定酶的用量酶本身的催化活性底物DNA的樣品1)用量當(dāng)前55頁，總共165頁。2)酶活單位1個(gè)酶活單位：在最適反應(yīng)條件下，在20l反應(yīng)液中反應(yīng)1小時(shí)，使1gDNA（標(biāo)準(zhǔn)DNA）完全消化所需的酶活性稱為1個(gè)單位。1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1μg標(biāo)準(zhǔn)DNA（λDNA

）所需的酶量容積活性：1μL酶液中具有的酶活性單位，即U/μL。當(dāng)前56頁，總共165頁。常規(guī)緩沖液(10X)

pH，Mg++，DTT/β-ME，①pH:7.0-7.9(at25℃)Tris-HCl②離子強(qiáng)度：NaCl

高中低100mM50mM0③Mg++:10mMMgCl2

，MgAc反應(yīng)緩沖液對絕大多數(shù)限制酶來說，在pH=7.4的條件下，其功能最佳。0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶酶活性的正常發(fā)揮，是絕對地需要二價(jià)的陽離子，通常是Mg2+。當(dāng)前57頁，總共165頁。④反應(yīng)條件大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是37℃一部分為50-65℃，少數(shù)25-30℃高溫作用酶于37℃時(shí),活性多數(shù)為10-50%。小提示：銷售商在產(chǎn)品說明中會(huì)標(biāo)明最佳反應(yīng)溫度不同的核酸內(nèi)切限制酶，具有不同的最適反應(yīng)溫度，而且彼此之間有相當(dāng)大的變動(dòng)范圍。當(dāng)前58頁，總共165頁。（七）TypeIIRE：星號(hào)活性（staractivity）Underextremeconditions,suchaselevatedpHorlowionicstrength,restrictionendonucleasesarecapableofcleavingsequenceswhicharesimilarbutnotidenticaltotheirdefinedrecognitionsequence.Thealteredspecificityisknownasstaractivity.高濃度的酶（>100U/g）、高濃度的甘油（>5%）、低離子強(qiáng)度（<25mM）、極端pH值(>pH8.0)等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性（專一性降低），即所謂的staractivity現(xiàn)象低特異性：可在不是原來的識(shí)別序列處切割DNA是限制內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn)*當(dāng)前59頁，總共165頁。引起星號(hào)活性的因素①反應(yīng)體系中甘油的濃度大于5%。②酶用量過大，大于100U/μgDNA。③低離子強(qiáng)度，小于25mmol/L。④高pH，大于8.0。⑤含有機(jī)劑，如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺等。⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價(jià)離子的存在。常發(fā)生星活性的內(nèi)切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。當(dāng)前60頁，總共165頁。當(dāng)前61頁，總共165頁。抑制staractivity的措施①減少酶的用量，避免過量酶切，減少甘油濃度②保證反應(yīng)體系中無有機(jī)溶濟(jì)或乙醇③提高離子強(qiáng)度到100～150mM(如果不會(huì)抑制的話)④降低反應(yīng)pH至pH7.0⑤使用Mg2+作為二價(jià)陽離子*當(dāng)前62頁，總共165頁。QuizQ：當(dāng)兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時(shí)，若要進(jìn)行雙酶切，應(yīng)采取什么措施?為什么?注意staractivity，先低鹽，后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一種酶失活，再加第二種酶，否則，易產(chǎn)生星號(hào)活性?；蚴褂猛ㄓ镁彌_液同時(shí)使用兩種酶進(jìn)行酶切。當(dāng)前63頁，總共165頁。（八）TypeIIRE：cuttingDNA單酶切雙酶切部分酶切當(dāng)前64頁，總共165頁。單酶切法環(huán)狀DNA分子產(chǎn)生與識(shí)別序列數(shù)（n）相同的DNA片段，且DNA片段的兩末端相同線形DNA分子產(chǎn)生n+1的DNA片段，即：采用一種酶對DNA進(jìn)行切割當(dāng)前65頁，總共165頁。雙酶切法即：采用兩種酶對DNA進(jìn)行切割。環(huán)狀DNA分子完全酶切DNA片段數(shù)為兩種限制酶識(shí)別序列之和:n1+n2線狀DNA分子完全酶切DNA片段數(shù)為兩種限制酶識(shí)別序列之和加1:n1+n2+1當(dāng)前66頁，總共165頁。重組克隆載體pMD18-T-RIP雙酶切電泳圖M:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ1:BamHI和SacI雙酶切后的重組克隆載體18-T-RIP當(dāng)前67頁，總共165頁。部分酶切即：選用的限制性酶對其在DNA分子上的全部識(shí)別序列進(jìn)行不完全的切割。原因：底物DNA純度低識(shí)別序列的甲基化酶用量的不足反應(yīng)緩沖液不適宜溫度不適宜反應(yīng)時(shí)間不足缺點(diǎn)：

影響需要的DNA片段的得率優(yōu)點(diǎn)：

根據(jù)重組設(shè)計(jì)的需要，專門創(chuàng)造部分酶切的條件，獲取需要的DNA片段當(dāng)前68頁，總共165頁。當(dāng)前69頁，總共165頁?？梢酝ㄟ^縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度或減少酶用量來實(shí)現(xiàn)、增大反應(yīng)體積。當(dāng)前70頁，總共165頁。Quiz當(dāng)前71頁，總共165頁。當(dāng)前72頁，總共165頁。酶切反應(yīng)如何終止？消化DNA樣品后，在進(jìn)一步處理DNA樣品前往往需要鈍化內(nèi)切酶的活性，鈍化大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的方法是65℃溫浴5分鐘。*當(dāng)前73頁，總共165頁。1、限制酶十分昂貴！2、限制酶在50%甘油中保存于-20℃最穩(wěn)定3、盡量減少反應(yīng)中的加水量4、延長消化時(shí)間可使所需酶量減少使用限制酶的注意點(diǎn)：不太常用的限制性內(nèi)切酶多保存在-70℃，每周或每天用的酶保存在-20℃。有一些酶需要不同的保存條件。小提示：使用限制性內(nèi)切酶時(shí)，一定要將酶保存在冰上。

當(dāng)前74頁，總共165頁。（九）TypeIIRE：影響RE活性的因素當(dāng)前75頁，總共165頁。當(dāng)前76頁，總共165頁。當(dāng)前77頁，總共165頁。當(dāng)前78頁，總共165頁。①在特異位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異限制性酶片段。②建立DNA分子的限制酶圖譜。③構(gòu)建基因文庫。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。⑤改建質(zhì)粒。（十）TypeIIRE：用途當(dāng)前79頁，總共165頁。VariationsoncuttingandjoiningDNAmolecules

（對DNA分子進(jìn)行切割、連接，綜合運(yùn)用各種酶，可產(chǎn)生不同的變化）ThegenerationofthreenewrestrictionsitesafterfillingintheoverhangsproducedbyendonucleaseEcoRIandligatingtheproductstogether.Notethattherearetwotargetsites,4bpapart,inthereconstitutedmoleculeforendonucleaseTsp509I.各種不同的工具酶組合，會(huì)產(chǎn)生不同的效果。這里需要DNA連接酶穿針引線。當(dāng)前80頁，總共165頁。小結(jié)當(dāng)前81頁，總共165頁。當(dāng)前82頁，總共165頁。2.DNAmodifyingenzymesOtherenzymesusedingeneticengineeringmaybelooselytermedDNAmodifyingenzymes,withthetermusedheretoincludedegradation,synthesis,andalterationofDNA.Inadditiontorestrictionendonucleases,thereareseveralothertypesofnucleaseenzymesthatareimportantinthemanipulationofDNA.Someofthemostcommonlyusedenzymesaredescribednext.當(dāng)前83頁，總共165頁。2.DNA修飾酶Nucleaseenzymesdegradenucleicacidsbybreakingthephosphodiesterbondthatholdsthenucleotidestogether.Restrictionenzymesaregoodexamplesofendonucleases,whichcutwithinaDNAstrand.*2.1Nucleases（核酸酶）當(dāng)前84頁，總共165頁。核酸外切酶（exonuclease）

核酸內(nèi)切酶(endonuclease)核酸酶從核酸鏈的一端開始按順序催化降解核苷酸的酶。從核酸鏈分子內(nèi)部切割3’，5’磷酸二酯鍵，使之?dāng)嗔研纬尚∑蜗ＥD文exo為外部之意，endo為內(nèi)部之意。*Q：核酸酶與核酶(ribozyme)之間有何區(qū)別？介紹幾個(gè)概念按作用特性的差異,可分為單鏈的核酸外（內(nèi)）切酶和雙鏈的核酸外（內(nèi)）切酶.當(dāng)前85頁，總共165頁。2.1.1FourusefulnucleasesApartfromrestrictionenzymes,therearefourusefulnucleasesthatareoftenusedingeneticengineering.TheseareBal31andexonucleaseIII(exonucleases),anddeoxyribonucleaseI(DNaseI)andS1-nuclease(endonucleases).當(dāng)前86頁，總共165頁。TheseenzymesdifferintheirprecisemodeofactionandprovidethegeneticengineerwithavarietyofstrategiesforattackingDNA.TheirfeaturesaresummarisedinFig.當(dāng)前87頁，總共165頁。Fig.4.5Modeofactionofvariousnucleases.(a)NucleaseBal31isacomplexenzyme.Itsprimaryactivityisafast-acting3exonuclease,whichiscoupledwithaslow-actingendonuclease.WhenBal31ispresentatahighconcentrationtheseactivitieseffectivelyshortenDNAmoleculesfrombothtermini.(b)ExonucleaseIIIisa3exonucleasethatgeneratesmoleculeswithprotruding5termini.(c)DNaseIcutseithersingle-strandedordouble-strandedDNAatessentiallyrandomsites.(d)NucleaseS1isspecificforsingle-strandedRNAorDNA.當(dāng)前88頁，總共165頁。具有單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性和雙鏈特異的核酸外切酶活性。當(dāng)前89頁，總共165頁。Bal31用于定位當(dāng)前90頁，總共165頁。應(yīng)用Bal31

核酸酶誘發(fā)DNA分子的缺失突變（a）質(zhì)粒DNA分子，A區(qū)段是準(zhǔn)備誘發(fā)缺失突變的序列（b）用Bal31核酸酶不同時(shí)間長度分別消化線性DNA分子，得到缺失長度不等的分子群體（c）將帶有另一種限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的銜接物連接到這些缺失分子上并將它們環(huán)化起來（d）新形成的環(huán)狀質(zhì)粒分子具有新的限制性內(nèi)切酶（HindIII）的切點(diǎn)，其A區(qū)段有缺失當(dāng)前91頁，總共165頁。S1核酸酶的用途1）定位RNA2）用mRNA測定基因中的外顯子序列不能配對的內(nèi)含子區(qū)域形成的單鏈環(huán)被S1切掉！當(dāng)前92頁，總共165頁。S1核酸酶的活性當(dāng)前93頁，總共165頁。S1定位RNA當(dāng)前94頁，總共165頁。當(dāng)前95頁，總共165頁。當(dāng)前96頁，總共165頁。當(dāng)前97頁，總共165頁。2.1.2其它核酸外切酶1）大腸桿菌核酸外切酶VII（單鏈）能從5’或3’末端降解DNA分子,而且是所討論的唯一的不需要Mg2+的核酸酶.當(dāng)前98頁，總共165頁。2）大腸桿菌核酸外切酶III（雙鏈）1.特點(diǎn)：來自E.coli，主要作用于ds-DNA,3’→5’外切酶活性，不降解ss-DNA.2.催化反應(yīng)類型（1）外切酶活性（2）核酸酶H活性（RNaseH活性）（3）內(nèi)切酶活性3.用途（1）核酸（DNA）標(biāo)記（2）產(chǎn)生缺口（3）DNA序列順序缺失

(4)還可作為雙脫氧DNA序列分析法的反應(yīng)底物,即制備單鏈DNA模板.

當(dāng)前99頁，總共165頁。2）大腸桿菌核酸外切酶III（雙鏈）RNaseH活性當(dāng)前100頁，總共165頁。當(dāng)前101頁，總共165頁。當(dāng)前102頁，總共165頁。當(dāng)前103頁，總共165頁。3）λ噬菌體核酸外切酶（雙鏈核酸外切酶）從單、雙鏈DNA的5’-PO4基末端逐步切下5’-PO4

單核苷酸，不能降解5’-OH端主要用途是將雙鏈DNA變?yōu)閱捂?，供測序使用；除去5’-端突起，產(chǎn)生3’-端突起，便于加尾當(dāng)前104頁，總共165頁。當(dāng)前105頁，總共165頁。2.1.3RibonucleasesInadditiontoDNA-specificnucleases,thereareribonucleases(RNases),whichactonRNA.ThesemayberequiredformanyofthestagesinthepreparationandanalysisofrecombinantsandareusuallyusedtogetridofunwantedRNAinthepreparation.當(dāng)前106頁，總共165頁。However,aswellasbeinguseful,ribonucleasescanposesomeunwantedproblems.Why?當(dāng)前107頁，總共165頁。Theyareremarkablydifficulttoinactivateandcanbesecretedinsweat.Thus,contaminationwithRNasescanbeaprobleminpreparingrecombinantDNA,particularlywherecDNAispreparedfromanmRNAtemplate.當(dāng)前108頁，總共165頁。InthiscaseitisvitaltoavoidRNasecontaminationbywearingglovesandensuringthatallglassandplasticequipmentistreatedtoavoidribonucleasecontamination.當(dāng)前109頁，總共165頁。Notallnucleasesarehelpful!RibonucleasescanbeaproblemwhenworkingwithpurifiedpreparationsofRNA,andcaremustbetakentoremoveorinactivateRNaseactivity.當(dāng)前110頁，總共165頁。2.2Polymerases（聚合酶）Polymerasesarethecopyingenzymesofthecell;theyarealsoessentialpartsofthegeneticengineer’sarmoury.Theseenzymesaretemplate-dependentandcanbeusedtocopylongstretchesofDNAorRNA.Polymeraseenzymessynthesisecopiesofnucleicacidmoleculesandareusedinmanygeneticengineeringprocedures.當(dāng)前111頁，總共165頁。2.2Polymerases（聚合酶）定義：EnzymesthatsynthesizeanewstrandofDNAcomplementarytoanexistingDNAorRNAtemplate.*當(dāng)前112頁，總共165頁。Whendescribingapolymeraseenzyme,theterms‘DNA-dependent’or‘RNA-dependent’maybeusedtoindicatethetypeofnucleicacidtemplatethattheenzymeuses.Thus,aDNA-dependentDNApolymerasecopiesDNAintoDNA,anRNA-dependentDNApolymerasecopiesRNAintoDNA,andaDNA-dependentRNApolymerasetranscribesDNAintoRNA.當(dāng)前113頁，總共165頁。Thesynthesisproceedsina5'→3'direction,aseachsubsequentnucleotideadditionrequiresafree3'-OHgroupfortheformationofthephosphodiesterbond.Thisrequirementalsomeansthatashortdouble-strandedregionwithanexposed3'-OH(aprimer)isnecessaryforsynthesistobegin.當(dāng)前114頁，總共165頁。FourtypesofDNApolymereasesusuallyusedingeneticengineering（4種常見的聚合酶）:1.共同特點(diǎn)：把dNTP連續(xù)地加到dsDNA分子的3’-羥基端，催化DNA分子聚合，而引物不從DNA模板上解離。2.主要區(qū)別：持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來。當(dāng)前115頁，總共165頁。2.2Polymerases（聚合酶）*1)DNApolymereaseI（FromE.coli,109kDa）2)Klenowfragment=E.coliDNApolymeraseIlargefragment(76kDa),枯草桿菌蛋白酶裂解DNApolymereaseI,從全酶中除去5’—3’外切酶活性片段，而聚合酶活性和3’—5’外切酶活性不受影響。3)TaqDNApolymerase4)Reversetranscriptase當(dāng)前116頁，總共165頁。當(dāng)前117頁，總共165頁。大腸桿菌DNA聚合酶I（DNAPOLYMERASEI）①基本性質(zhì)當(dāng)前118頁，總共165頁。②基本用途

當(dāng)前119頁，總共165頁。大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(KLENOWFRAGMENT)【★】

①Klenow酶的基本性質(zhì)大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，PolI就裂解為大小不同的兩個(gè)活性片段，較大的C端片段具有聚和酶和3’

-5’核酸外切酶活性但失去了5`→3`的核酸外切酶活性，即Klenow酶。當(dāng)前120頁，總共165頁。目前以將DNA聚合酶基因內(nèi)的相應(yīng)編碼序列克隆表達(dá)，并由重組大腸桿菌廉價(jià)生產(chǎn)。當(dāng)前121頁，總共165頁。②KLENOW酶的基本用途A.補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3′粘性凹進(jìn)末端或5′粘性凸出末端；抹平DNA的3′粘性凸出末端當(dāng)前122頁，總共165頁。B.DNA片段的同位素末端標(biāo)記當(dāng)前123頁，總共165頁。

C.cDNA第二鏈的合成

D.雙脫氧末端終止法測定DNA序列當(dāng)前124頁，總共165頁。T4DNA聚合酶(T4PHAGEDNAPOLYMERASE)【★】

①T4DNA酶的基本特性有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性。在無dNTP時(shí)，可以從任何3`-OH端外切。在只有一種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸。在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位。當(dāng)前125頁，總共165頁。當(dāng)前126頁，總共165頁。②基本用途

當(dāng)前127頁，總共165頁。當(dāng)前128頁，總共165頁。TaqDNApolymerase從棲熱水生菌（Thermusaquaticus)中分離純化的依賴DNA的DNA聚合酶。63kDaActivities:5′3DNApolymerase5′3exonuclease(無35′外切酶作用，因此無校正功能)特點(diǎn)：thermo-stable(耐高溫)。應(yīng)用：PCR反應(yīng)中常用。*知識(shí)提升：TaqDNA聚合酶的特性:在DNA雙鏈的3’端再加上一個(gè)多余的核苷酸(優(yōu)先加A).當(dāng)前129頁，總共165頁。SourcesofthermostableDNApolymerasewithproofreading(3’-5’exonuclease)acitivity當(dāng)前130頁，總共165頁。T7DNA聚合酶1．來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的，由兩個(gè)亞基組成：①T7基因5編碼的大亞基，有5’-3’聚合酶和3’-5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白，增加大亞基對模板的親和性。當(dāng)前131頁，總共165頁。2．T7DNA聚合酶的特點(diǎn)①持續(xù)合成能力強(qiáng)，一旦與模板結(jié)合就會(huì)不間斷地合成互補(bǔ)鏈。②3’-5’外切酶活性高，單鏈和雙鏈都能降解。③不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響。其它DNA聚合酶受DNA二級結(jié)構(gòu)的阻礙當(dāng)前132頁，總共165頁。3．T7DNA聚合酶的用途①以大分子量DNA為模板的合成②進(jìn)行末端標(biāo)記。取代合成法標(biāo)記3’末端，這與T4DNA聚合酶相同。③補(bǔ)平隱蔽末端。合成補(bǔ)平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。

當(dāng)前133頁，總共165頁。修飾后的T7DNA聚合酶T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾是去除了其3’-5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。修飾后的T7DNA聚合酶的用途：①雙脫氧法DNA測序；②標(biāo)記DNA3’隱蔽末端；③更有效地補(bǔ)平末端。

當(dāng)前134頁，總共165頁。Reversetranscriptase(反轉(zhuǎn)錄酶)反轉(zhuǎn)錄酶具有5’→3’的DNA聚合酶活性，以RNA為模板聚合cDNA鏈，同時(shí)又具有3’→5’和5’→3’的RNA外切核酸酶活性（

RNaseH活性）。*當(dāng)前135頁，總共165頁。Reversetranscriptase(反轉(zhuǎn)錄酶)1．Variety：兩種商品化的反轉(zhuǎn)錄酶（兩個(gè)來源）AMV禽成髓細(xì)胞瘤病毒

Mo-MLV(M-MuLV)Moloney鼠白血病病毒2.Activities：

5’→3’DNA聚合活性（Mg++）

RNaseH活性3．Application：cDNA克隆5’突出DNA的3’端補(bǔ)平測序反應(yīng)(代替Klenow大片段)*當(dāng)前136頁，總共165頁。2.3EnzymesthatmodifytheendsofDNAmoleculesAlkalinephosphatase(堿性磷酸酶，去除5’磷酸基團(tuán))Function：Removesthephosphategrouppresentatthe5’terminusofaDNAmolecule.去除DNA分子5’末端的磷酸基團(tuán)（若用于載體DNA5’末端，則可防止DNA片段自身聚合狀）*當(dāng)前137頁，總共165頁。Alkalinephosphatase

(堿性磷酸酶)ApplicationofalkalinephosphatasetreatmenttopreventrecircularizationofvectorplasmidwithoutinsertionofforeignDNA.堿性磷酸酶可使被切開后的載體去磷酸化，防止其自身環(huán)化。①克隆時(shí)去除載體的5’-P，以防載體自連它的應(yīng)用當(dāng)前138頁，總共165頁。②在用激酶進(jìn)行5’末端標(biāo)記前，去除DNA的5’-P當(dāng)前139頁，總共165頁。2.3EnzymesthatmodifytheendsofDNAmolecules*Polynucleotidekinase(多核苷酸激酶，在5’端增加磷酸基團(tuán))Organism：FromE.coliinfectedwithT4phageFunction：Addphosphategroupsontofree5’terminus.給DNA5’末端增加磷酸基團(tuán)，形成自由的5’-P，以利于DNA的連接。當(dāng)前140頁，總共165頁。Polynucleotidekinase(多核苷酸激酶)TheforeignDNAplusligatedadaptorsisphosphorylatedatthe5’-terminibypolynuleotidekinase.多核苷酸激酶可使5’末端發(fā)生磷酸化，使之能與DNA3’末端正常連接。當(dāng)前141頁，總共165頁。用途:1)5’-端末端標(biāo)記當(dāng)前142頁，總共165頁。2)分子克隆過程中獲得5’-磷酸基末端，便于連接酶反應(yīng)當(dāng)前143頁，總共165頁。它能進(jìn)行兩種反應(yīng)當(dāng)前144頁，總共165頁。2.3EnzymesthatmodifytheendsofDNAmolecules*Terminaldeoxynucleotidyltransferase(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，末端轉(zhuǎn)移酶)

Organism：Fromcalfthymus(胸腺)tissueFunction：Addsoneormoredeoxyribonucleotides(脫氧核糖核苷酸)ontothe3’terminusofDNAmolecule.催化脫氧核苷酸添加到DNA分子的3’-OH末端，催化作用不需要模板。當(dāng)前145頁，總共165頁。terminaldeoxynucleotidyltransferase

(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶,末端轉(zhuǎn)移酶)底物：帶有突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈DNA分子均可作為TdT的底物；以3’-突起端的雙鏈DNA為最高，亦可用于雙鏈DNA加尾*當(dāng)前146頁，總共165頁。TdT的用途①同聚物加尾：給外源DNA片段和載體分子分別加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。同聚物尾巴（homopolymerictail)：當(dāng)反應(yīng)混合物中只有一種dNTP時(shí)，就可以形成僅由一種核苷酸組成的3’尾巴。稱這種尾巴為同聚物尾巴。當(dāng)前147頁，總共165頁。再生酶切位點(diǎn)：克隆片段。當(dāng)前148頁，總共165頁。放射性與非放射性標(biāo)記DNA片段的3’端催化非放射性標(biāo)記物參入DNA片段的3’端。如生物素-11-dUTP等。當(dāng)前149頁，總共165頁。3.DNAligase(DNA連接酶)

E.coli

andphageT4encodeanenzyme,DNAligase,

whichsealssingle-strandednicksbetweenadjacentnucleotidesinaduplexDNAchain.Ingeneticengineeringitisusedtosealdiscontinuitiesinthesugar—phosphatechainsthatarisewhenrecombinantDNAismadebyjoiningDNA‘molecularglue’;withrestrictionmoleculesfromdifferentsources.Itcanthereforebethoughtofasmolecularglue(分子膠水).DNAligaseisessentially‘molecularglue’;withrestrictionenzymes,itprovidesthetoolsforcuttingandjoin