抗生素類藥物的分析

第一節(jié)概述定義：在低微濃度下即可對某些生物的生命活動有特異抑制作用的化學物質(zhì)的總稱。來源:＊多數(shù)抗生素生物合成(發(fā)酵)＊少數(shù)化學合成或者半合成1當前1頁，總共84頁。性質(zhì)復雜：化學純度低——三多：同系物多異構(gòu)體多降解物多活性組份易變異穩(wěn)定性差2當前2頁，總共84頁。1、抗生素類藥物一般檢查項目：①鑒別試驗:用化學法、物理化學法以及生物學法來確認是哪種抗生素②毒性試驗:控制藥品中的毒性物質(zhì)③無菌試驗:檢查藥品中有無雜菌污染④熱源試驗:控制藥品中的致熱物質(zhì)⑤水分測定:控制水分含量⑥溶液澄明度檢查:檢查不溶性物質(zhì)⑦

溶液pH試驗:測定pH⑧降壓試驗:檢查有降壓作用的雜質(zhì)⑨

效價測定:有效成分測定3當前3頁，總共84頁。

2、效價測定抗生素活性表示方法：效價。效價：每毫升或每毫克含有某種抗生素的有效成分的多少?？股氐男r測定方法有:生物學法物理化學法目前各國藥典仍以生物學測定法為主。青霉素鈉：1670單位/毫克慶大霉素：590單位/毫克4當前4頁，總共84頁。(1)

生物學測定法以抗生素抑制細菌生長能力或殺菌能力作為衡量效價標準。優(yōu)點：①原理恰好與臨床要求一致，更能夠確定抗生素效價。②靈敏度高，需要樣品量較?、?/p>

既適用較純精制品,也適用于純度較差的產(chǎn)品④

已知或新發(fā)現(xiàn)抗生素都能應用⑤同一類型的抗生素,不需要分離,可一次測定它們的總效價。缺點:①

操作步驟多，測定時間較長②

誤差較大5當前5頁，總共84頁。(2)

物理化學測定法根據(jù)抗生素化學結(jié)構(gòu)利用其特有的化學或物理化學性質(zhì)及反應進行。優(yōu)點:①

操作簡單、省時、方法準確②

具有較高的專屬性缺點:對于結(jié)構(gòu)相似的抗生素，測定結(jié)果往往只能代表總的含量，并不一定能代表某一抗生素的生物效價，只有當用物理化學法測定結(jié)果與用生物學法測定效價相一致時，才能用于效價測定。6當前6頁，總共84頁。3、本章內(nèi)容＊-內(nèi)酰胺類:青霉素類頭孢菌素類＊氨基糖苷類: 鏈霉素慶大霉素＊四環(huán)素類7當前7頁，總共84頁。一、化學結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1、化學結(jié)構(gòu)①

青霉素類結(jié)構(gòu)母核:由-內(nèi)酰胺環(huán)和氫化噻唑環(huán)組成的雙雜環(huán)。6-氨基青霉烷酸（6－APA）母核無UV吸收不穩(wěn)定***酸性第二節(jié)-內(nèi)酰胺類抗生素的分析8當前8頁，總共84頁。（青霉素G、芐青霉素）9當前9頁，總共84頁。氨芐西林

（氨芐青霉素）10當前10頁，總共84頁。阿莫西林

（羥氨芐青霉素）11當前11頁，總共84頁。②

頭孢菌素類結(jié)構(gòu)母核:-內(nèi)酰胺環(huán)和二氫噻嗪環(huán)組成的雙雜環(huán)。不穩(wěn)定酸性**7-氨基頭孢菌烷酸（7－ACA）母核有UV吸收12當前12頁，總共84頁。頭孢氨芐13當前13頁，總共84頁。頭孢拉定14當前14頁，總共84頁。頭孢羥氨芐15當前15頁，總共84頁。2、性質(zhì)青霉素類和頭孢菌素類結(jié)構(gòu)共同特點：具有-內(nèi)酰胺環(huán)。①

酸性＊有羧基，具有酸性＊pKa值在2.5-2.8之間＊與堿成鹽如：青霉素G鈉、青霉素G鉀等16當前16頁，總共84頁。②

旋光性有手性碳原子，具有旋光性3個手性碳原子（C3、C5、C6）2個手性碳原子（C6、C7）17當前17頁，總共84頁。③

紫外吸收＊青霉素類母核沒有共軛系統(tǒng)，沒有紫外吸收＊但青霉素類藥物在弱酸性下水解，可以產(chǎn)生具有共軛雙鍵的青霉烯酸，在紫外光區(qū)有吸收。＊側(cè)鏈中有苯環(huán)等取代基的藥物，在紫外光區(qū)也有吸收。像芐青霉素。＊頭孢菌素類分子中有共軛體系（O＝C－N－C＝C），在260nm處有最大吸收。18當前18頁，總共84頁。19當前19頁，總共84頁。④-內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性干燥、純凈青霉素類抗生素穩(wěn)定，其水溶液很不穩(wěn)定，不穩(wěn)定的部分是-內(nèi)酰胺環(huán)。-內(nèi)酰胺環(huán)在酸、堿、青霉素酶、某些金屬離子的作用下，可使-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)或發(fā)生分子重排，而失去抗菌作用。20當前20頁，總共84頁。21當前21頁，總共84頁。二、鑒別試驗1、羥肟酸鐵反應(β-內(nèi)酰胺類)22當前22頁，總共84頁。2、茚三酮反應△23當前23頁，總共84頁。3、雙縮脲反應（β-內(nèi)酰胺類）似肽鍵（開環(huán)分解）24當前24頁，總共84頁。4、與變色酸-硫酸反應（活潑“-CH2-”）青霉素阿莫西林氨芐西林25當前25頁，總共84頁。5、與重氮苯磺酸反應（酚羥基）（偶合）舉例：頭孢哌酮26當前26頁，總共84頁。6、UV法頭孢氨芐λmax=262nm青霉素V鈉A280nm/A264nm=1.30～1.50Cu2+27當前27頁，總共84頁。7、IR法（chp2010版）

該類抗生素共有的特征峰：－內(nèi)酰胺環(huán)羰基（1750～1800cm-1

）；仲酰胺的氨基、羰基（3300cm-1，1525cm-1，1680cm-1）；羧酸離子（1600cm-1、1410cm-1）；取代苯（760～850cm-1）28當前28頁，總共84頁。29當前29頁，總共84頁。8、色譜法（1）TLC法（2）HPLC法（chp2010版）30當前30頁，總共84頁。1、碘量法①原理：青霉素或頭孢菌素分子不消耗碘，其在堿性條件下水解生成的降解產(chǎn)物—青霉噻唑酸可與碘作用，根據(jù)消耗的碘量可以計算青霉素的含量。

三、含量測定31當前31頁，總共84頁。②方法：以“青霉素鈉”為例（1）主試驗：32當前32頁，總共84頁。（2）空白試驗：空白試驗：做法與一般空白不同（加樣品,不加堿水解,其他操作同樣品）＊目的：消除樣品中預先存在的降解產(chǎn)物（青霉噻唑酸）及其他耗碘雜質(zhì)的影響33當前33頁，總共84頁。2、HPLC法（chp2010）特點：快速、高效、靈敏專屬性強、重現(xiàn)性好一法多用（鑒別、檢查、含測）34當前34頁，總共84頁。頭孢呋辛酯例35當前35頁，總共84頁。第三節(jié)氨基糖苷類抗生素的分析一、化學結(jié)構(gòu)及性質(zhì)（一）鏈霉素1、結(jié)構(gòu)36當前36頁，總共84頁。鏈霉素37當前37頁，總共84頁。2、性質(zhì)：（1）三個堿性中心：2個強堿性胍基（PKa=11.5）

1個甲胺基（PKa=7.7）可與礦酸或有機酸成鹽（硫酸鹽）（2）鏈霉素在酸性或堿性條件下可變?yōu)殒溍闺液玩溍闺p糖胺38當前38頁，總共84頁。（二）慶大霉素1、結(jié)構(gòu)39當前39頁，總共84頁。2、性質(zhì)：（1）五個堿性中心可與礦酸或有機酸成鹽（2）無UV吸收，（因為無共軛系統(tǒng)）40當前40頁，總共84頁。二、鑒別試驗（一）共同反應1、茚三酮反應氨基糖苷結(jié)構(gòu)，具羥基胺類和α-氨基酸的性質(zhì)，可與茚三酮縮合成藍紫色縮合物?！?1當前41頁，總共84頁。2、N-甲基葡萄糖胺反應（Elson-Morgan反應）水解產(chǎn)物N-甲基葡萄糖胺特有反應。42當前42頁，總共84頁。3、Molisch試驗該類藥物酸水解后，在鹽酸（硫酸）作用下脫水成糠醛或羥甲基糠醛，遇α-萘酚或蒽酮顯色。43當前43頁，總共84頁。4、SO42-反應H+5、TLC法6、IR法7、UV法8、HPLC法44當前44頁，總共84頁。（二）鏈霉素的特征反應1、麥芽酚反應：鏈霉素在堿性溶液中，鏈酶糖經(jīng)分子重排，消除N—甲基葡萄糖胺及鏈酶胍，生成麥牙酚，麥牙酚可與鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。45當前45頁，總共84頁。46當前46頁，總共84頁。2、坂口反應（鏈霉胍特有反應）47當前47頁，總共84頁。1.微生物檢定法：本法系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用量反應平行線原理的設(shè)計，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。三、含量測定（鏈霉素、慶大霉素）2.衍生化HPLC法：選用OPA為熒光衍生化試劑。（2005版）3.直接HPLC法：蒸發(fā)光散射檢測器（2010版）48當前48頁，總共84頁。第四節(jié)四環(huán)素類抗生素的分析49當前49頁，總共84頁。四環(huán)素（TC）

tetracycline50當前50頁，總共84頁。金霉素(CTC)

chlortetracycline51當前51頁，總共84頁。一、化學結(jié)構(gòu)52當前52頁，總共84頁。A環(huán)B環(huán)C環(huán)D環(huán)二甲氨基—N(CH3)2酚羥基酰胺基—CONH2酮基與烯醇共共軛酮基與烯醇基共軛雙鍵系統(tǒng)雙鍵系統(tǒng)53當前53頁，總共84頁。二、性質(zhì)1、呈兩性：弱酸性——酚羥基、烯醇型羥基弱堿性——二甲胺基所以遇酸或堿均可成鹽54當前54頁，總共84頁。2、含結(jié)晶水四環(huán)素：6個結(jié)晶水占19.6%土霉素：2個結(jié)晶水占7.5%

加熱時可失去結(jié)晶水,當含水量低于19.6%的四環(huán)素和低于7.5%的土霉素,置于空氣中要吸收水分。55當前55頁，總共84頁。3、溶解度：游離體在水中溶解度很小，溶解度與pH有關(guān)。難溶于水,pH低于4或高于8時,可以得到高濃度的水溶液.56當前56頁，總共84頁。4．穩(wěn)定性：對各種氧化劑都不穩(wěn)定，且堿性水溶液特別易氧化，顏色很快變深形成色素，干燥品較穩(wěn)定，但貯存時遇光可使顏色變深（因空氣氧化）。57當前57頁，總共84頁。三．化學反應：1.差向異構(gòu)化反應：（差向四環(huán)素）弱酸性（pH2.0-6.0）溶液中，A環(huán)上手性C4構(gòu)型的改變，發(fā)生差向異構(gòu)化，形成差向四環(huán)素。差向化速度的影響因素：pH<2或pH>9時，差向化速度很小。高價的無機酸或有機酸根存在或陰離子濃度增加，差向化速度增大。58當前58頁，總共84頁。59當前59頁，總共84頁。2.酸性下降解反應:（脫水四環(huán)素類）在酸性（pH<2）時，C環(huán)上C6上羥基易脫落與C5a上的氫生成水，在C6-C5a間形成雙鍵。經(jīng)重排使C環(huán)芳構(gòu)化，生成脫水四環(huán)素類。四環(huán)素、土霉素和金霉素可發(fā)生脫水；強力霉素不發(fā)生（C6無OH）。60當前60頁，總共84頁。61當前61頁，總共84頁。3.堿性下降解反應：（異四環(huán)素類）在堿性下，C環(huán)打開，生成無活性的具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的異四環(huán)素；若強堿性下加熱，可定量地轉(zhuǎn)化為異四環(huán)素，后者具有強烈熒光，可熒光法測定。強力霉素不發(fā)生反應，因C6無OH。62當前62頁，總共84頁。4.與金屬離子絡合：能與許多金屬離子（鋯Zr4+,鈾U6+,鋅Zn2+,銅Cu2+,鋁Al3+,鎂Mg2+，鈰Ce4+,鈷Co2+）形成有色絡合物。63當前63頁，總共84頁。四．鑒別試驗1.

與濃硫酸反應：64當前64頁，總共84頁。2.FeCl3反應：65當前65頁，總共84頁。3．熒光反應：四環(huán)素類在紫外燈下產(chǎn)生熒光，其降解產(chǎn)物也具有熒光，可供鑒別。66當前66頁，總共84頁。4、HPLC法5、TLC法6、IR法7、UV法67當前67頁，總共84頁。五．雜質(zhì)檢查：(一)有關(guān)物質(zhì)降解產(chǎn)物及異構(gòu)雜質(zhì),會造成藥品質(zhì)量下降?？梢饜盒?、嘔吐、糖尿、蛋白尿及酸中毒，稱為Fanconi癥侯群。68當前68頁，總共84頁。引起毒性反應的主要物質(zhì)為差向異構(gòu)體、脫水物、差向脫水物質(zhì)，統(tǒng)稱為有關(guān)物質(zhì)。ChP2010采用HPLC法檢查。脫水物和差向脫水物含量越高，其吸收度越大，因此，ChP還規(guī)定雜質(zhì)的吸收度的限量。

4-差向四環(huán)素（ETC）脫水四環(huán)素（ATC）差向脫水四環(huán)素（EATC）鹽酸金霉素（CTC）

69當前69頁，總共84頁。（二）雜質(zhì)吸收度鹽酸四環(huán)素λmax=268nmλmax=355nm70當前70頁，總共84頁。71當前71頁，總共84頁。系統(tǒng)適用性試驗1.防護柱2.預試溶液

4-差向脫水四環(huán)素四環(huán)素3.RSD≤2.0%六、含量測定-----HPLC法（外標法）72當前72頁，總共84頁。第五節(jié)抗生素藥物中高分子雜質(zhì)的檢查1、為何要進行抗生素中高分子雜質(zhì)的檢查？

抗生素是臨床用量最大和較易發(fā)生不良反應的藥物。其中最常見的一類不良反應就是過敏反應。多年來的研究已證明，在β－內(nèi)酰胺類抗生素所致的速發(fā)型過敏反應中，藥物分子本身只是半抗原，藥物中存在的高分子雜質(zhì)才是引發(fā)速發(fā)型過敏反應的真正過敏原，因此嚴格控制抗生素中高分子雜質(zhì)的含量有著重要的意義。73當前73頁，總共84頁。2、高分子聚合物的分類

抗生素中的高分子雜質(zhì)系指藥品中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)總稱，其分子量一般在1000～5000Da，個別可達10000Da左右。β－內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)按其來源通常被分為兩類：外源性雜質(zhì)和內(nèi)源性雜質(zhì)。

外源性雜質(zhì)包括蛋白、多肽、多糖等類雜質(zhì)或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的結(jié)合物，來源于發(fā)酵工藝，如青霉素中的青霉噻唑多肽等。

內(nèi)源性雜質(zhì)是指抗菌藥物的自身聚合產(chǎn)物，聚合物既可來自生產(chǎn)過程，又可在儲存中形成，甚至在用藥時也可產(chǎn)生。對于現(xiàn)在的生產(chǎn)工藝，外源性的高分子雜質(zhì)已經(jīng)較少產(chǎn)生，對內(nèi)源性聚合物的控制是當前抗生素高分子雜質(zhì)質(zhì)量控制的重點。

74當前74頁，總共84頁。3.高分子雜質(zhì)的控制方法

凝膠色譜法（分子排阻色譜法）是根據(jù)分子大小進行分離的一種液相色譜技術(shù)。藥物分子進入凝膠孔徑內(nèi)部，保留時間較長。而高分子雜質(zhì)則被排阻在外，在色譜過程中不被保留，最早被洗脫出來，保留時間較短。

根據(jù)β-內(nèi)酰胺類抗生素和其高分子雜質(zhì)的分子量，選用SephadexG-10

作為β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)分離色譜系統(tǒng)的凝膠介質(zhì)。SephadexG-10排阻分子量在1000道爾頓左右。根據(jù)β-內(nèi)酰胺類抗生素在不同離子強度的介質(zhì)中具有不同表現(xiàn)狀態(tài)的性質(zhì)，建立了凝膠色譜自身對照外標法定量測定β-內(nèi)酰胺類抗生素中的聚合物。此方法已經(jīng)載入《中國藥典》2000-2010年版，用于國產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類抗生素的質(zhì)量控制。75當前75頁，總共84頁。采用兩種流動相：流動相A--pH=7.0的磷酸鹽緩沖液，流動相B--純化水或0.1％十二烷基硫酸鈉；凝膠介質(zhì)：SephadexG-10；檢測波長254nm；采用流動相A

：除部分寡聚物外，β－內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)在色譜過程中均不保留；即所有的高分子雜質(zhì)表現(xiàn)為單一的色譜峰，其Kav＝0。采用流動相B：β－內(nèi)酰胺類抗生素可以形成締合物，導致其表觀分子量增大；此時在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中藥物和高分子雜質(zhì)具有相似