分子生物學分子克隆技術(shù)剖析

分子生物學分子克隆技術(shù)剖析第1頁/共86頁2參考書目資料《分子克隆實驗指南》（第三版）：美J.薩姆布魯克等著,黃培堂等譯，科學出版社，2008.《GeneIX》：BenjaminLewin編著.《基因工程原理》：吳乃虎，科學出版社，1998.《分子生物學實驗指導》：郜金榮，葉林柏，武漢大學出版社，2007.《基因工程》：張惠展，華東理工大學出版社，2005.第2頁/共86頁3分子克隆第3頁/共86頁4第4頁/共86頁5基因工程是指在微觀領(lǐng)域（分子水平）中，根據(jù)分子生物學和遺傳學原理，設計并實施一項把一個生物體中有用的目的DNA(遺傳信息)轉(zhuǎn)入另一個生物體中，使后者獲得新的需要的遺傳性狀或表達所需要的產(chǎn)物，最終實現(xiàn)該技術(shù)的商業(yè)價值?；蚬こ痰幕咎攸c是，分子水平操作，細胞水平表達?；蚬こ袒蚬こ膛c建筑工程第5頁/共86頁6重組DNA技術(shù)的重大突破帶動了現(xiàn)代生物技術(shù)的興起，并很快產(chǎn)生了許多生命科學的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)。重組DNA技術(shù)，又稱為基因或分子克隆技術(shù)，是基因工程的核心技術(shù)。該技術(shù)包括了一系列的分子生物學操作步驟?；蚬こ痰暮诵募夹g(shù)是DNA重組技術(shù)第6頁/共86頁7分子克隆技術(shù)

又稱為重組DNA技術(shù)，是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序。供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。第7頁/共86頁8重組DNA操作一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；（3）用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細胞，并能在受體細胞中復制和遺傳；（4）對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（5）對獲得外源基因的細胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達出所需要的產(chǎn)物。第8頁/共86頁9獲得需要的目的基因（外源基因）獲得需要的目的基因常用的方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因文庫(genelibrary)，從中調(diào)用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補的DNA片段；（3）利用聚合酶鏈式反應（PCR）特異性地擴增所需要的目的基因片段，等等。第9頁/共86頁10細胞內(nèi)總DNA的提取分離與基因文庫的構(gòu)建細胞內(nèi)總DNA的提取分離程序第10頁/共86頁11紫外分光光度計測定DNA溶液的純度和濃度。第11頁/共86頁12基因工程的工具酶“手術(shù)刀”專司切割之職，內(nèi)切酶“縫紉針”具有連接之功，連接酶“復印機”行使復制之責，DNA聚合酶第12頁/共86頁13(“交通工具車子”)——載體有了切割與縫合（ligase）基因DNA的工具，還得有一個“車子”將重組DNA送到宿主細胞中去。

第13頁/共86頁14逆轉(zhuǎn)錄酶使真核基因的制備成為可能。

（1）真核基因組龐大而復雜，不易制得基因圖譜。（2）即使有了基因圖譜，因為真核基因有內(nèi)含子，不能在原核表達系統(tǒng)剪接出mRNA，沒有成熟的mRNA就不能得到相應得產(chǎn)物。（3）經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄mRNA→cDNA(complementoryDNA)得到的cDNA文庫要比基因組文庫小得多，所以篩選陽性克隆就方便得多。

第14頁/共86頁15四、分子克隆的技術(shù)支撐核酸凝膠電泳技術(shù)核酸分子連接技術(shù)細菌轉(zhuǎn)化技術(shù)DNA序列分析技術(shù)寡核苷酸合成技術(shù)基因定點突變技術(shù)聚合酶鏈反應（PCR）技術(shù)DNA序列測定技術(shù)第15頁/共86頁16核酸凝膠電泳第16頁/共86頁17細菌轉(zhuǎn)化技術(shù)（包括感受態(tài)細胞制備）第17頁/共86頁18聚合酶鏈反應（PCR）技術(shù)第18頁/共86頁19大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)野生細胞野生細胞分離工程酶分離工程基因工程蛋白質(zhì)工程途徑工程

工程細胞發(fā)酵工程酶工程細胞工程生物活性物質(zhì)第19頁/共86頁20第20頁/共86頁21

用攜帶了外源基因的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體，發(fā)育成具有新性狀的完整植株——轉(zhuǎn)基因植物。

第21頁/共86頁22基因工程的工具酶“手術(shù)刀”專司切割之職“縫紉針”具有連接之功“復印機”行使復制之責內(nèi)切酶連接酶聚合酶第22頁/共86頁23內(nèi)切酶“手術(shù)刀”專司切割之職“縫紉針”具有連接之功“復印機”行使復制之責內(nèi)切酶連接酶聚合酶第23頁/共86頁24內(nèi)切酶第24頁/共86頁25同裂酶(Isoschizomers）第25頁/共86頁26同尾酶第26頁/共86頁27星活性*所謂星活性又稱Star活性。是指由于反應條件不同而產(chǎn)生的切斷與原來認識序列不同的位點的現(xiàn)象，也就是說產(chǎn)生Star活性后，不但可以切斷特異性的識別位點，還可以切斷非特異性的位點。產(chǎn)生Star活性的結(jié)果是酶切條帶增多。Differenceswhichcanleadtostaractivityincludelowionicstrength,highpH,andhigh(>5%v/v)glycerolconcentrations.HighFidelity(HF)RestrictionEnzymescanbeusedtoreducestaractivity.第27頁/共86頁28第28頁/共86頁29DNA聚合酶Taq酶 用Taq酶擴增DNA時常使片段3‘端凸出一個A。Pfu酶 產(chǎn)生平末端產(chǎn)物。第29頁/共86頁30連接酶T4DNALigase(invitrogen)16°C過夜或者室溫1-2個小時了連接即可。第30頁/共86頁31基因工程的載體---用于擴增第31頁/共86頁32克隆載體必備條件（1）具有復制起點（2）具有抗菌素抗性基因（3）具有若干限制酶單一識別位點（4）具有較小的相對分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)。第32頁/共86頁33表達型基因工程的載體----以PET32為例第33頁/共86頁34多克隆位點第34頁/共86頁35宿主要考慮宿主菌對密碼子的偏愛性大腸桿菌不同密碼子的偏愛性問題，將64組密碼子分為強、中、弱密碼子第35頁/共86頁36目的產(chǎn)物目的基因不溶性的高效表達過程：目的基因編碼的真核蛋白質(zhì)與宿主基因編碼的原核多肽或或其它基因編碼的具有其它功能的多肽和結(jié)合在一起，這種結(jié)合在一起的形成的不溶性無活性的包涵體，又叫為融合蛋白。舉例：胰島素與β-半乳糖苷酶形成包涵體優(yōu)點：避免細菌蛋白酶破壞，提高目的基因表達產(chǎn)物產(chǎn)量。缺點：需要經(jīng)過溶解和復性才能獲得有活性的適合：不需要翻譯后修飾的蛋白質(zhì)產(chǎn)物第36頁/共86頁37目的基因的高效分泌表達概念：目的蛋白分泌到細胞周質(zhì)和目的蛋白轉(zhuǎn)運到細胞周質(zhì)后再分泌到細胞外優(yōu)點：①防止宿主菌對表達產(chǎn)物的降解；②有利于蛋白質(zhì)正確折疊，形成天然構(gòu)象③減輕宿主細胞代謝負荷④有利于分離需要在質(zhì)粒設計時加入一段信號肽基因第37頁/共86頁38基因克隆操作過程第38頁/共86頁39克隆示意圖第39頁/共86頁40克隆示意圖第40頁/共86頁41克隆技術(shù)流程分切連轉(zhuǎn)篩第41頁/共86頁42分分離（來自生物組織）、擴增（設計引物，PCR擴增）mRNA-------DNA------擴增第42頁/共86頁43引物設計與訂購酶切位點雙酶切、保護堿基、最合適的緩沖液。引物訂購第43頁/共86頁44保護堿基第44頁/共86頁451.用限制性酶消化

DNA樣品第45頁/共86頁46單酶切第46頁/共86頁47雙酶切第47頁/共86頁48選擇合適的雙酶切緩沖液第48頁/共86頁492.用限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒DNA第49頁/共86頁503.連接樣品DNA和質(zhì)粒DNA的消化產(chǎn)物第50頁/共86頁51連接前最好要定量連接比例摩爾比例為： 插入片度：質(zhì)粒=10:1---5:1為佳。質(zhì)粒幾十個ng為佳。第51頁/共86頁52雙酶切EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。第52頁/共86頁53冷循環(huán)器第53頁/共86頁544.用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化細菌有兩個基本方法。一是

化學法，即用CaCl2

處理并加熱激以促進DNA進入菌體；二是電激法，即

施加短脈沖的電荷以促進DNA吸收。第54頁/共86頁55用氯化鈣化學轉(zhuǎn)化第55頁/共86頁56用氯化鈣化學轉(zhuǎn)化第56頁/共86頁57電激轉(zhuǎn)化第57頁/共86頁58一個電激轉(zhuǎn)化程序加50-200ngDNA到40ul電激感受態(tài)細菌中將混合物放入一個預冷的電激杯中施以脈沖電處理，脈沖長度預期值為8to12ms立即加1mlLB培養(yǎng)液，在室溫下振蕩2-4小時。

分別取10ul和100ul涂布在到兩個加有抗菌素的LB瓊脂平板上，保溫培養(yǎng)1天。第58頁/共86頁595.

細菌在加有Amp+X-Gal的培養(yǎng)基上生長以進行篩選連接會有三種結(jié)果，一是要插入的序列自連；二是切開的質(zhì)粒重連；三是要插入的序列與質(zhì)粒相連。第一種連接結(jié)果沒有菌落形成。第二種連接結(jié)果表現(xiàn)為藍色菌落。只有后一種結(jié)果是符合需要的，產(chǎn)生白色的抗氨芐青霉素菌落。第59頁/共86頁60滅菌器第60頁/共86頁61加IPTG和X-GAL第61頁/共86頁62倒平板第62頁/共86頁63

α互補利用α互補原理篩選重組體pUC18第63頁/共86頁64篩選結(jié)果藍菌落代表含有質(zhì)粒的耐藥菌，表達出由完好的α

LacZ序列編碼的功能性的

α

片段。白菌落代表含有質(zhì)粒的耐氨芐青霉素菌，質(zhì)粒上α

LacZ序列上有插入片段。第64頁/共86頁65乳糖和誘導物IPTG的化學結(jié)構(gòu)isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside第65頁/共86頁66X-galX-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的顯色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下會產(chǎn)生藍色產(chǎn)物。常用于β-半乳糖苷酶的原位染色檢測以及藍白斑篩選。

第66頁/共86頁67X-gal水解第67頁/共86頁68篩選結(jié)果模式圖第68頁/共86頁69藍菌落建議用DH5α做宿主菌。

第69頁/共86頁70藍白菌落第70頁/共86頁71電泳儀第71頁/共86頁72經(jīng)過雙酶切、PCR等鑒定，送陽性克隆測序。提取正確的克隆菌中的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入表達型的菌株，如BL21等。誘導表達蛋白第72頁/共86頁73鑒定方法第73頁/共86頁74

PCR鑒定第74頁/共86頁75

原位雜交第75頁/共86頁76雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學方法第76頁/共86頁77蛋白質(zhì)的純化第77頁/共86頁78謝 謝！第78頁/共86頁79多利誕生的過程

為什么震驚和驚呼，我們先了解一下多利誕生的過程以及胚胎細胞克隆和體細胞克隆的區(qū)別這兩個基本問題，對我們學習后面內(nèi)容或許有所幫助和啟發(fā)。多利誕生的過程：

1.取出第一只成年母羊乳腺的普通細胞，分離基因備用。

2.取出第二只母羊未受精的卵細胞，取出基因換上第一只羊乳腺細胞基因（“掉包”），放電激活該卵細胞，使之象正常受精卵一樣進行細胞分裂，直至一定階段，胚胎成熟。