第二基因工程技術(shù)原理及在農(nóng)藥中的應(yīng)用

第二基因工程技術(shù)原理及在農(nóng)藥中的應(yīng)用本章，我們主要討論4個(gè)問(wèn)題：1.什么是基因工程——基因工程的概念。2.為什么能進(jìn)行基因工程——基因工程的原理和技術(shù)。（包括3大理論和3大技術(shù)準(zhǔn)備）3.怎樣進(jìn)行基因工程——3大步驟（DNA體外重組，重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞后擴(kuò)增和表達(dá)，基因工程后處理）4.基因工程的應(yīng)用和前景——對(duì)于醫(yī)學(xué)來(lái)說(shuō)即生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品、開(kāi)展基因治療等，在農(nóng)藥中的應(yīng)用。2第一節(jié)概述一.現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的3個(gè)特點(diǎn)：

（一）科學(xué)技術(shù)加速發(fā)展和急劇變革：1.當(dāng)代科學(xué)發(fā)展成指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，全世界發(fā)表科技論文6000－8000/天，平均1篇/10.8秒問(wèn)世。2.人類(lèi)科技知識(shí)在19世紀(jì)半衰期是50年，現(xiàn)在是3－5年（終身教育學(xué)習(xí)）。

3.1973年，CohenGroup第一次實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移terr+nersr→terrner，導(dǎo)致基因工程技術(shù)誕生，至今不到30年，人類(lèi)已經(jīng)擁有了克隆羊、豬等等的技術(shù)，可以復(fù)制一個(gè)生命體。（克隆羊多利1997－2003，體細(xì)胞克隆，胚胎細(xì)胞克?。?PscloltetrRb-3nersrtetrnertetr

nerOtetrne圖1CohenGroup第一次實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀轉(zhuǎn)移示意圖4(二)科學(xué)技術(shù)發(fā)展的綜合化

1.19世紀(jì)中葉，以科學(xué)技術(shù)是分離的，它們各有獨(dú)自文化傳統(tǒng)，它們的發(fā)展往往是脫節(jié)的。2.科學(xué)回答“是什么”“為什么”，技術(shù)回答“做什么”“怎么做”。當(dāng)今科技發(fā)展已經(jīng)密不可分，科學(xué)里包含技術(shù)，技術(shù)里體現(xiàn)科學(xué)。3.當(dāng)代科技發(fā)展有兩種形式：一是突破，二是融合。突破是線(xiàn)性的，即從研究開(kāi)發(fā)新一代的科技成果取代原有一代科技成果。融合是非線(xiàn)性的，即混合原有不同的科技領(lǐng)域，進(jìn)而發(fā)展新產(chǎn)品，造成革命性市場(chǎng)，它們是互補(bǔ)和合作的結(jié)果?；蚬こ碳仁强茖W(xué)又是技術(shù)，既是突破，又是融合。她造成革命性市場(chǎng)（美國(guó)基因工程產(chǎn)品300億美元/年，乙肝疫苗50美元/人）；她是分子遺傳學(xué)，生物化學(xué)，細(xì)胞學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)相互滲透，交叉融合、突破的結(jié)果。5(三)科技發(fā)展必需和人文社會(huì)科學(xué)發(fā)展相結(jié)合：

1.當(dāng)代各種全球性問(wèn)題出現(xiàn)，從一定意義上來(lái)說(shuō)是由于科學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于社會(huì)而引發(fā)的，如TMD、NMD(布什對(duì)薩達(dá)姆)2.科學(xué)技術(shù)是第一生產(chǎn)力，而文化水平是人類(lèi)把握科學(xué)技術(shù)的一個(gè)尺度。3.科學(xué)技術(shù)是一把雙刃劍，原子核技術(shù)可以給人類(lèi)帶來(lái)光明，原子彈卻可以把長(zhǎng)崎、廣島夷為平地；克隆技術(shù)，基因工程技術(shù)可以挽救瀕臨滅絕的動(dòng)物（國(guó)寶熊貓），也可以動(dòng)搖人類(lèi)以性愛(ài)為基礎(chǔ)的生產(chǎn)方式……（冷冰冰克隆人和自然人，情人節(jié)少了一個(gè)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)；克隆戰(zhàn)爭(zhēng)狂人和反戰(zhàn)英雄；克隆idea孫悟空齊天大圣）?；蚬こ碳夹g(shù)是當(dāng)代科學(xué)技術(shù)重要的前沿。6二．基因工程的概念（一）基因（gene）

基因從化學(xué)上來(lái)說(shuō)，指的是一段DNA或RNA順序，該順序可以產(chǎn)生或影響某種表型（genotype，phenotype），可以由于突變生成等位基因變異體（體細(xì)胞父源和母源；正常和突變基因）；從遺傳學(xué)上來(lái)說(shuō)，基因代表一個(gè)遺傳單位，一個(gè)功能單位，一個(gè)突變單位。（二）基因工程（geneticengineering）

基因工程

在體外通過(guò)人工剪、接，將不同來(lái)源的DNA分子組成一個(gè)雜合DNA分子(DNA分子重組體)，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞去復(fù)制擴(kuò)增或表達(dá)。因?yàn)橥ㄟ^(guò)人工設(shè)計(jì),得到一定的設(shè)計(jì)方案，故稱(chēng)為基因工程。由于整個(gè)操作在分子水平上進(jìn)行，所以也稱(chēng)分子克隆。

基因工程的基本特點(diǎn)是，分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá)。

7

在這個(gè)過(guò)程中：1.“基因剪刀”

剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀”2.“縫紉針”

連接不同來(lái)源DNA分子的酶就像一根“縫紉針”，使二者連在一起3.“交通工具”使用載體好比一輛車(chē)子

4.“乘客”

有用基因如IL2好比使乘客，車(chē)子把乘客送進(jìn)理想天堂（宿主細(xì)胞）去繁衍生息，春華秋實(shí)，生產(chǎn)我們需要的產(chǎn)品或開(kāi)展基因治療（IL2/LAK→抗癌）。8

我們應(yīng)該記住他們——1.第一個(gè)實(shí)現(xiàn)DNA重組的人－Berg1972年，Berg用E.coRⅠ切割SV40DNA和λphageDNA，經(jīng)過(guò)連接組成重組的DNA分子。Berg是第一個(gè)實(shí)現(xiàn)DNA重組的人。2.第一個(gè)取得基因工程成功的人－Cohen

1973年，CohenGroup將E.coli的tetr質(zhì)粒psclol和nersrR6-3質(zhì)粒體外限制酶切割，連接成一個(gè)新的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli，在含四環(huán)素和新霉素的平板上篩選出了terrNer,實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移。這是基因工程史上的第一個(gè)克隆化并取得成功的例子，這一年被定為基因工程誕生的元年。9三．基因工程克隆技術(shù)――人類(lèi)對(duì)自然的干預(yù)（一）遺傳和變異是生物學(xué)的一對(duì)重要概念。

1.遺傳賦予生物種的穩(wěn)定，保證生物種的延綿不斷（不能斷香火）。2.變異賦予生物種的進(jìn)化，保證生物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)。3.遺傳和變異這一對(duì)矛盾在一個(gè)生物體內(nèi)統(tǒng)一起來(lái)。4.在生物演變的歷史長(zhǎng)河中，自然發(fā)生的變異是相當(dāng)相當(dāng)緩慢的。5.隨著生物科學(xué)的發(fā)展，尤其是基因工程技術(shù)的誕生，人類(lèi)開(kāi)始干預(yù)生物的變異（福耶禍耶？無(wú)法定論）6.經(jīng)典的遺傳學(xué)千百萬(wàn)年才能積累出現(xiàn)的有利的變異，通過(guò)基因工程手段幾十年乃至幾年就可以實(shí)現(xiàn)。而時(shí)至今日，幾乎一發(fā)不可收拾。10(二)多利

1997年2月23日，Nature雜志報(bào)道，英國(guó)愛(ài)丁斯堡羅斯林研究所和PPL生物技術(shù)公司已經(jīng)成功克隆了一只名叫多利的綿羊（1997－2003/7/12）。這一消息的公布，全世界震驚的程度不亞于原子彈在長(zhǎng)崎和廣島的爆炸，在全球引起了軒然大波，以至世人驚呼：不要讓科學(xué)瘋狂！為什么以前胚胎克隆沒(méi)有在世界上引起軒然大波呢?原因是此克隆非彼克隆，多利取自功能徹底分化的成年動(dòng)物乳腺細(xì)胞，即體細(xì)胞。它推翻了遺傳學(xué)上一條上百年的定律：體細(xì)胞功能高度分化，不可能重新發(fā)育成個(gè)體。11（三）多利誕生的過(guò)程

為什么震驚和驚呼，我們先了解一下多利誕生的過(guò)程以及胚胎細(xì)胞克隆和體細(xì)胞克隆的區(qū)別這兩個(gè)基本問(wèn)題，對(duì)我們學(xué)習(xí)后面內(nèi)容或許有所幫助和啟發(fā)。多利誕生的過(guò)程：1.取出第一只成年母羊乳腺的普通細(xì)胞，分離基因備用。2.取出第二只母羊未受精的卵細(xì)胞，取出基因換上第一只羊乳腺細(xì)胞基因（“掉包”），放電激活該卵細(xì)胞，使之象正常受精卵一樣進(jìn)行細(xì)胞分裂，直至一定階段，胚胎成熟。3.將成熟的胚胎移植到第三只母羊子宮中發(fā)育，妊娠（同正常一樣），最后產(chǎn)下多利。這樣一只與第一只羊基因百分之百一樣的復(fù)制品誕生了。12（四）此克隆非彼克隆

胚胎細(xì)胞克隆體細(xì)胞克隆供體細(xì)胞胚胎細(xì)胞（核）體細(xì)胞（核）受體細(xì)胞去核未受精的卵細(xì)胞去核未受精的卵細(xì)胞發(fā)育場(chǎng)所母體宮腔母體宮腔關(guān)鍵區(qū)別克隆的是子代（多生了一個(gè)）復(fù)制的是自己（復(fù)制了一個(gè)）13（五）克隆是一把雙刃劍

試想，有了克隆技術(shù)，有人在你毫不知曉的情況下復(fù)制一個(gè)“你”去犯罪，怎么辦？試想，有了克隆技術(shù)，一些極權(quán)的政治野心家一下子克隆出好幾個(gè)戰(zhàn)爭(zhēng)狂人希特勒、墨索里尼，怎么辦？還有，有了克隆技術(shù)，世界上同時(shí)生活著多個(gè)你、我、父母、兄弟、姐妹，按現(xiàn)行的社會(huì)倫理道德很難為其“名份”定位，又該怎么辦？因此說(shuō)克隆對(duì)人類(lèi)社會(huì)倫理道德提出了一場(chǎng)非同尋常的挑戰(zhàn)，平添一系列是我非我、是父非父、是妻非妻、是子非子之類(lèi)的麻煩事，絕非危言聳聽(tīng)。從社會(huì)倫理角度看，用克隆技術(shù)培育出的人，有其特定的生理性狀，這對(duì)人類(lèi)的自然發(fā)展和人種的自然構(gòu)成無(wú)疑會(huì)產(chǎn)生極大的影響。14

從家庭倫理角度看，將克隆技術(shù)用于人體繁殖，會(huì)加劇家庭多元化傾向，還會(huì)從根本上改變?nèi)说挠H系關(guān)系，確定人類(lèi)親系關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)也將發(fā)生改變。從性倫理角度看，它完全改變了人類(lèi)自然的基于性愛(ài)的生育方式，使人口的生產(chǎn)與性愛(ài)分離，從而破壞男女之間基于性受而獲得后代的情感，并由此改變?nèi)祟?lèi)的基本性倫理關(guān)系。從遺傳學(xué)上看，人本來(lái)是由兩性細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn)生的，這種結(jié)合有利于人種進(jìn)化，而克隆使人的遺傳基因成為單一的，勢(shì)必導(dǎo)致人種退化。從哲學(xué)上看，克隆還會(huì)使人們正常的生與死的概念發(fā)生動(dòng)搖。15四．基因工程3大理論，3大技術(shù)準(zhǔn)備：（一）理論上的3大發(fā)現(xiàn)：1.20世紀(jì)40年代，Avery發(fā)現(xiàn)了生物遺傳物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)是DNA。超越時(shí)代的科學(xué)成就往往不易被人們接受，Avery當(dāng)時(shí)并未贏(yíng)得陣陣掌聲，他的論文事隔10年以后才公開(kāi)發(fā)表。2.20世紀(jì)50年代，Watson-crick提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，搞清楚了生物遺傳物質(zhì)的分子機(jī)制。3.20世紀(jì)60年代，確定了遺傳信息的傳遞方式：DNA→RNA→Pr,破譯了全部遺傳密碼，43。16（二）技術(shù)上的3大發(fā)明：1．“基因剪刀”－限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)明

（1）20世紀(jì)40－60年代，科學(xué)家們就為基因工程設(shè)計(jì)了美好的藍(lán)圖，但是面對(duì)龐大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手無(wú)策，無(wú)從下手把它切成單個(gè)基因片斷。（2）當(dāng)時(shí)的酶學(xué)知識(shí)已有相當(dāng)?shù)陌l(fā)展，但是沒(méi)有一個(gè)已發(fā)現(xiàn)的酶能完成這樣的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血桿菌（Haemophilusinffuenzae）分離純化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁錮，迎來(lái)了改造生物的春天，為基因工程奠定了最為重要的技術(shù)基礎(chǔ)。172．載體(“交通工具車(chē)子”)－基因工程技術(shù)誕生的第二個(gè)技術(shù)準(zhǔn)備

（1）

有了切割與縫合（ligase）基因DNA的工具，還得有一個(gè)車(chē)子（富康）將重組DNA送到宿主細(xì)胞中去。（2）1946年起，Lederberg就研究細(xì)菌性因子（F因子）.50-60年代相繼發(fā)現(xiàn)了R因子（抗藥因子），CoE(大腸桿菌因子)等質(zhì)粒。（3）然而，直到1973年Cohen才能將質(zhì)粒作為基因工程載體使用（至今一直是基因工程最重要最廣泛使用的載體）。這是基因工程的第二個(gè)技術(shù)準(zhǔn)備。18

3．逆轉(zhuǎn)錄酶－1970年Baltimove和Temin等同時(shí)各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了遺傳學(xué)（生物學(xué)）中心法則，使真核基因的制備成為可能。（原因如下）(1)真核基因組龐大而復(fù)雜，不易制得基因圖譜。HGP2005年完成，2.8萬(wàn)個(gè)基因，1－3kb/基因，104，2.2*1011公里。（2）即使有了基因圖譜，因?yàn)檎婧嘶蛴袃?nèi)含子，不能在原核表達(dá)系統(tǒng)剪接出mRNA，沒(méi)有成熟的mRNA就不能得到相應(yīng)得產(chǎn)物。（3）經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄mRNA→cDNA(complementoryDNA)文庫(kù)要比基因組文庫(kù)小得多，所以篩選陽(yáng)性克隆就方便得多。有了這些理論核技術(shù)的武裝，基因工程的臨盆降生指日可待，Berg和Cohen兩位科學(xué)的“助產(chǎn)士”，把基因工程接到了人間。19五．與基因工程相關(guān)的概念：（一）克?。╟lone,cloning）：

1.原意是指單細(xì)胞純系無(wú)性繁殖。2.現(xiàn)代概念是將實(shí)驗(yàn)得到的人們所需的微量基因結(jié)構(gòu)，引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中去。在合適的生理環(huán)境中進(jìn)行無(wú)性繁殖，從而利用宿主的生理機(jī)制繁衍人們所需要的基因結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行表達(dá)。由于整個(gè)操作在分子水平上進(jìn)行，所以稱(chēng)為分子克?。╩olecularcloning）。3.

這個(gè)術(shù)語(yǔ)的幾種含義：

（1）作為名詞

①帶有相同插入順序的重組DNA分子的1個(gè)群體。②基因型（genetype）相同的細(xì)胞或生物體的一個(gè)群體。③最常用的是描述一個(gè)微生物的一個(gè)菌落，這些微生物帶有插入了特定DNA片斷的載體分子。

（2）作為動(dòng)詞，是“去克隆”，即利用體外DNA重組技術(shù)將一個(gè)特定的基因或DNA順序插入一個(gè)載體分子。20

（二）重組DNA技術(shù)(DNArecombinationtechnique)

是用酶學(xué)的方法將不同來(lái)源的DNA在體外切割，連接組成一個(gè)雜合的DNA分子的技術(shù)?；蚬こ贪―NA重組技術(shù)，現(xiàn)將相關(guān)的概念關(guān)系列表如下。

（三）生物工程（Biologicengineering）：是更大范圍內(nèi)生產(chǎn)及產(chǎn)品的工程技術(shù)，是現(xiàn)代生物學(xué)中一切工程技術(shù)的總稱(chēng)，包括：

1.遺傳工程（geneticengineering）

比較基因工程有更廣泛的內(nèi)容，包括基因工程，但基因工程不等于遺傳工程，凡是人工改造遺傳性狀的技術(shù)都稱(chēng)之遺傳工程，有個(gè)體的，細(xì)胞的，分子水平的。

（1）基因工程：①DNA重組；②DNA體外誘變；③體外基因操作；④基因化學(xué)合成等。（2）物理化學(xué)誘變；（3）細(xì)胞融合（4）花粉培育（5）有性雜交等。

2．發(fā)酵工程3．酶學(xué)工程4．細(xì)胞工程5．農(nóng)業(yè)工程6．希望工程21第二節(jié)工具酶常用的工具酶（toolenzymes）有：

1.限制性核酸內(nèi)切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)2.DNA連接酶（DNAligase,ligase)3.逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)4.DNA聚合酶(DNApolymerase,DNApol)5.核酸酶(nuclease)6.末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)7.堿性磷酸酶(BAP或CIP)以1.和2.最為常用，最為重要。工具酶現(xiàn)已商品化。22一．限制性核酸內(nèi)切酶（一）限制酶的概念（定義，分類(lèi)，命名，限制與修飾辨正關(guān)系）1.定義限制酶（restrictionendonuclease,restrctionenzymes）是一類(lèi)專(zhuān)門(mén)切割DNA的酶，它們能特異結(jié)合一段被稱(chēng)為限制酶識(shí)別順序的特殊DNA序列。并切割dsDNA。所謂限制（restriction）=切割（clearage）=水解（hydrolysis）該部位的核苷鍵（磷酸二酯鍵）2.分類(lèi)限制酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的（400多種E/350M）。所有的限制酶可分成3類(lèi)。

（1）Ⅰ、Ⅲ型，兼具限制與修飾活性，它們識(shí)別與切割順序不在一個(gè)地方，不產(chǎn)生特異性的DNA片段，與基因工程意義不大（有說(shuō)Ⅲ型識(shí)別核切割的位點(diǎn)一致，但罕見(jiàn)）。

（2）Ⅱ型基因工程說(shuō)到的限制酶是Ⅱ型酶，具有此類(lèi)酶的微生物限制－修飾系統(tǒng)分別由限制酶核甲基化酶來(lái)完成。Ⅱ型酶分子量小，僅需Mg2＋作為催化反應(yīng)的輔因子，識(shí)別與切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生特異的DNA片段。233.

命名（1973年Smith原則、Ⅱ型酶）根據(jù)分離此酶微生物的學(xué)名，一般取3個(gè)字母。第一個(gè)字母大寫(xiě)該微生物屬名前的第一個(gè)字母第二、三個(gè)字母小寫(xiě)該微生物種名前的2個(gè)字母第四個(gè)字母大寫(xiě)有變種或品系的第一個(gè)字母羅馬字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ從一種微生物中發(fā)現(xiàn)了幾種限制酶，按發(fā)現(xiàn)順序排列

如EcoRⅠ是指從大腸桿菌（Escherichiacoli）R株分離得到的第一種限制酶。24

(二)限制酶的識(shí)別位點(diǎn)1．

一般特征（4點(diǎn)）：（1）Ⅱ型酶識(shí)別的特殊DNA序列稱(chēng)為限制酶的識(shí)別位點(diǎn)（或切割位點(diǎn)）。

（2）它能識(shí)別dsDNA的4－6bp的回文序列并水解該部分的核苷鍵。一般來(lái)說(shuō)是4－6bp，有6個(gè)以上的，但沒(méi)有4個(gè)以下的。（3）識(shí)別順序呈二重對(duì)稱(chēng)，即1800旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)。如：

GCCGGTNACGAATTCHhaCGGCMaeⅢCANTGEcoRⅠCTTAAG(4)酶靶順序大小是很重要的，它決定產(chǎn)生特定DNA中段的大小。若DNA堿基組成是均一的，限制酶切點(diǎn)是隨機(jī)的，那么對(duì)于：①

要求4bp靶序列如HpaⅡ,MboⅠ等在龐大DNA鏈上平均44核苷酸即可遇到一個(gè)靶序列，即1/256②

同理，要求6bp的酶，則平均46遇到一個(gè)靶序列，即1/4096。25

2.識(shí)別簡(jiǎn)并序列;

簡(jiǎn)并序列是指序列中有核苷酸位可以是不同的核苷酸。如：GTYRACY=C或TR=G或AYR=CG或CA或TG或TAHinⅡ?qū)嶋H上可以識(shí)別4個(gè)特定序列。3.識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)不同，但二者距離是一定的(某些酶識(shí)別位點(diǎn)在切割位點(diǎn)附近),即產(chǎn)生特定的DNA片段，這是與Ⅰ型酶的區(qū)別之一。

HgaⅠ識(shí)別位點(diǎn)GACGC→5/10(核苷酸距離)→dsDNA上切割5ˊGACGCNNNNN↓NNNNN3ˊ3ˊCTGCGNNNNNNNNNN↑5ˊ先識(shí)別（搞清楚）滑行一段距離再切，此稱(chēng)為Distantcleavage

26

(三)限制酶的切割位點(diǎn)：限制性對(duì)dsDNA2條鏈同時(shí)切割（其具體切割點(diǎn)，即磷酸二酯鍵斷開(kāi)的位點(diǎn)，相對(duì)二重對(duì)稱(chēng)軸的位置而異）產(chǎn)生3種不同切口：1．

形成平頭末端（flush或bluntend）如－TC↓GA-smaⅠbsuRⅠor–TC3ˊ+5ˊGA-－AG↓CT-AluⅠ-AG5ˊ+3ˊCT-2.形成5′－粘性末端（5′－cohesiveend即3′延伸末端）5′-GAATTC3′EcoRⅠ5′-GAATTC-3′+3′-CTTAAG5′3′-CTTAAG-5′3.形成3′－粘性末端（3′－cohesiveend）5′CTGCAG3′pstⅠG-3′5′-CTGCA+3′GACGTC5′ACGTC-5′3′-G粘性末端（stickyend）—限制酶切割產(chǎn)生2個(gè)突出的末端稱(chēng)之，作用是放在一起自發(fā)形成雙鏈。2728常用限制酶的種類(lèi)及切割方式29（四）同裂酶(isoschizomers)

通常不同的酶識(shí)別不同的順序，然而有許多不同源限制酶產(chǎn)生相同的末端，此即同裂酶。1．異源同工酶（Isoschizomers:來(lái)源不同，識(shí)別順序相同，切割方式可同可不同：(1)識(shí)別順序與切割方式同，如：MboⅠ5′和SauSⅠ3′（－NN↓GATCNN-3′）-NNCTAG↓NN-5′(2)識(shí)別順序同，切割位點(diǎn)不同，如：SmaⅠ和XmaⅠCCC↓GGGC↓CCGGG(3)識(shí)別與切割相同，但其中一酶可以切“修飾”（甲基化*），另一酶不能。如：HpaⅡ→CCGGMspⅠ→CCG*GMboⅠ→GATCSau3A→GA*TC2.一個(gè)位點(diǎn)包含在另一個(gè)位點(diǎn)之中（稱(chēng)subsets-識(shí)別與切割相互有關(guān)的酶稱(chēng)之。）

HpaⅡCC↓GGSmaⅠ的6個(gè)bp含HpaⅡ的4個(gè)bp順序，所以HpaⅡSmaⅠCCC↓GGG能識(shí)別與切割SmaⅠ的6個(gè)bp，但含有HpaⅡ的ccgg其它6核苷酸順序都不能被SmaⅠ切割。3．同尾酶（isoaudumers-識(shí)別順序不同，產(chǎn)生粘性末端相同的酶稱(chēng)之。）

BamHⅠG↓GATCC由此產(chǎn)生的DNA片段可借粘性末端相互連接，Sau3AN↓GATCN在DNA重組時(shí)具有更大的靈活性。30

(五)限制酶得正常識(shí)別切割能力是buffer的或幾個(gè)因子的函數(shù)（1－8等）

1.酶濃度2.酶的專(zhuān)一性3.離子濃度4.pH5.溫度6.底物濃度、純度7.2價(jià)離子：Mg2+、Mn2+、Co2+、Zn2＋8.保護(hù)劑：甘油、DMSO、甲酰胺Polisky證明，Mgcl2從5mM下降至2mM，pH值上升到8.5，EcoRI專(zhuān)一性從6bp下降至4bp即NAATN,這種識(shí)別AATT的EcoRI稱(chēng)EcoRI*。一種限制酶可能被它識(shí)別位點(diǎn)的甲基所抑制，這對(duì)于組建DNA甲基化圖譜是很重要的，是研究一個(gè)動(dòng)向。對(duì)于限制反應(yīng)機(jī)制，盡管書(shū)上列出1，2步反應(yīng)，但人們更關(guān)注他的應(yīng)用。所以這方面資料極少（全球1－2人）。（六）限制酶的應(yīng)用：

1．DNA重組2.分子雜交受體體段DNA3.DNA序列分析4.制備DNA指針5.基因定位,DNA7.DNA甲基化堿基的識(shí)別和切割8.組建新質(zhì)粒31DNA物理圖譜——標(biāo)明限制酶在DNA分子上的限制位點(diǎn)數(shù)，限制性片段的大小及排列順序的圖譜稱(chēng)之或稱(chēng)限制性圖譜。組建圖譜是基因工程的第一步工作（很難，拿來(lái)主義多，受惠贈(zèng)，千萬(wàn)注意要圖譜，不要受騙），與基因定位，轉(zhuǎn)錄，消化，分離，分子雜交，克隆轉(zhuǎn)化有直接的關(guān)系。32二．DNA連接酶：DNA連接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNAligase.（一）功能：催化有互補(bǔ)順序的兩個(gè)dsDNA分子的粘性末端或平頭末端3′－OH、5′－P連接作用。（二）來(lái)源－噬菌體T4感染Ecoli分離的一種單鏈多肽酶、MW.68KD。（三）催化反應(yīng)：

（1）需要ATP、Mg2+作輔助因子；（2）缺刻（Nick）DNA也可作該酶的底物。（3）對(duì)粘性末端催化活性大于平頭末端（酶量1：100）33三、逆轉(zhuǎn)錄酶（一）概述

逆轉(zhuǎn)錄酶也稱(chēng)反轉(zhuǎn)錄酶或RNA依賴(lài)的DNA聚合酶（RNAdependentDNApolymerase,RDDP）。是由Baltimove從鼠白血病病毒（murineleukemiavirus,MLV）和Mizutan從勞氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus,RSV)中，于1970年分別各自發(fā)現(xiàn)的，這兩個(gè)小組論文同時(shí)在同一期Nature上，可見(jiàn)其意義。該酶在逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）生產(chǎn)循環(huán)中起主宰作用。（二）功能基因工程中主要用于逆轉(zhuǎn)錄mRNA→cDNA（complementoryDNA）。（三）商品化逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種

①AMV（禽成髓細(xì)胞瘤）②Mc-MLV(鼠白血病病毒)。34（四）酶的活性

由于尚不完全清楚原因，sscDNA能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)EcoliDNApolⅠkelnow片段或錄酶合成cDNA第二條鏈，（多年來(lái)除了自身引導(dǎo)合成cDNA第二條鏈外別無(wú)它法）。逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，它的酶活性有：1.逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA2.DNA依賴(lài)DNApol以ssDNA為模板，3′－OHDNA片段為引物，按5′→3′合成DNA鏈。3.

RnaseH外切RNA酶活性，底物是RNA－DNA雜交分子RNA鏈，有兩種：①5′→3′外切RNA，稱(chēng)5′→3′外切RNA酶；②3′→5′外切RNA酶，稱(chēng)3′→5′外切RNA酶，也稱(chēng)RnaseH。4.DNA內(nèi)核酸酶Mn2＋存在時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄酶能切cccDNA，此活性無(wú)專(zhuān)一位點(diǎn)，對(duì)熱不穩(wěn)定。5.

DNA解旋酶類(lèi)似unwinding。35四、DNA聚合酶：

DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA，基因工程常用的酶有：（一）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliDNApolⅠ）

1956年，A.kornberg首先從E.coli中分離得到。是由1條多肽鏈組成的球蛋白直徑65，MW109KD，并以蛋白敏感的多肽接頭折疊成兩個(gè)區(qū)域含19－45％а螺旋結(jié)構(gòu)，分子中有單鏈巰基，每分子含1個(gè)Zn2＋原子，還不能證明Zn2＋參加了催化反應(yīng)，酶活性中心有3個(gè)密切相連的結(jié)合位點(diǎn)－即DNA核模，核苷磷酸（估計(jì)引物，生長(zhǎng)鏈痘結(jié)合在這里）和dNTP結(jié)合位點(diǎn)。1．E.coliDNApol由大小兩亞基組成，具有3種酶活性，即大亞基5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶及小亞基的5′→3′外切酶活性：（1）5′→3′DNA聚合酶活性以ssDNA為模板，沿引物3′－OH方向，按模板順序從5′→3′延伸。5′CCGATA－OHE.coliDNApolⅠ5′CCGATAGCCT3′3′GGCTATCGGA5′Mg2＋dDNP3′GGCTCGGA5′36四、DNA聚合酶：

DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA，基因工程常用的酶有：（一）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliDNApolⅠ）

（2）3′→5′外切酶活性即從游離的3′－OH末端降解ssDNA或dsDNA，其意義在于識(shí)別和消除不配對(duì)的核酸，保證DNA復(fù)制的忠實(shí)性。其dsDNA外切活性可被5′→3′聚合活性所抑制。5’CGCATCG-OH3’E.coliDNApolⅠ5’CGC3’GCGMg2＋3’GCG＋dAdTdCdG其dsDNA外切酶活性可被5′→3′DNA聚合酶活性所抑制。（3）5′→3′外切酶活性：從游離的5’端降解dsDNA成單核苷酸或寡核苷酸，也降解DNA:RNA雜交體RNA成分（具有RnaseH活性）5’－CTCATTAG－3’E.coliDNApolⅠ5’－CATTAG3’－GCGTAATC－5’Mg2＋3’－GCGTAATC+pC,pG372.E.coliDNApolⅠ(DNApolⅠ)在基因工程的應(yīng)用：

（1）制備高比活性的探針DNApolⅠ可催化DNA缺口移位反應(yīng)（Nicktranslation），為基因工程制備高比活性放射性探針（放標(biāo)，非放標(biāo)，32P，地高辛6400.00/盒）5’――――――――3’3’――――――――5’dsDNAMg2＋↓DNA酶Ⅰ5’—3’（3’—5’）↓32PdNTP,DNApolⅠ（全酶）（2）用于分子克?。ㄌ畛淙笨诶谥亟M）

DNApolⅠ能填充DNA的小缺口區(qū)（Gappedregion）→以便有效在體外用于DNA分子重組，如：①切割cccdsDNA分子作載體時(shí)②插入一段不具粘性末端的DNA片段或加入1個(gè)同源順序ssDNA片段③此時(shí)用DNApolⅠ填充這個(gè)缺口④再用ligase(3’-OH,P-5′)連接，組成重組DNA分子。38（3）DNA序列分析

DNApolⅠ是3種測(cè)測(cè)序法（Sanger雙脫氧法（測(cè)序自動(dòng)化原理同Sauger雙脫氧法），化學(xué)降解法和加減法）中的關(guān)鍵試劑→每個(gè)方法的成敗都取決于DNApolⅠ從融合引物復(fù)制的ssDNA的能力（詳參DNA的序列測(cè)定），這里僅作簡(jiǎn)介。①

Sauger雙脫氧法DNApolⅠ參入了2’3’－雙脫氧核苷酸到相應(yīng)的融合了的引物中，從而終止了鏈的進(jìn)一步延伸，這樣每個(gè)大小不同片段都帶有ddNTP。經(jīng)過(guò)PAGE測(cè)出DNA順序。②

化學(xué)降解法當(dāng)Mg2＋被Mn2＋取代時(shí)，DNApolⅠ有參與相應(yīng)NTP取代dNTP的能力，參與的這個(gè)NTP可以作為1個(gè)特殊切割位點(diǎn)而被降解，得到帶有NTP末端的DNA片段，這是化學(xué)法測(cè)序的主要原理。39（3）DNA序列分析③

加減法主要原理是在限制使用dNTP條件下加入DNApolⅠ和T4誘導(dǎo)的DNApol同時(shí)反應(yīng)。在減法反應(yīng)中從4個(gè)反應(yīng)混合物中每4個(gè)dNTP中減去1個(gè)。生長(zhǎng)鏈沿著引物延伸至缺少的那個(gè)dNTP為止。在加法反應(yīng)中所用的dNTP只有1種，如dATP，通過(guò)DNApol3′→5′外切酶活性使鏈終止在帶有A的3’末端用其它3種dNTP進(jìn)行類(lèi)似反應(yīng)，這樣通過(guò)加或減法8個(gè)混合物的電泳結(jié)果即可推出DNA鏈的順序。40（二）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－Klenow片段酶

基因工程很多情況下，E.coliDNApolⅠ可用它的1個(gè)大片段Klenow片段酶代替。該酶是枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解E.coliDNApolⅠ所得到的。

1.Klenow大片段是一條多肽鏈，MW76KD，保留了E.colipolⅠ的5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶活性。

2.Klenow在基因工程用于：(1)補(bǔ)平用限制酶消化dsDNA得到的5’粘性末端（即3’延伸末端）5’－G-OHKlenow,Mg2＋5’－GAATT3’－CTTAADntp3’－CTTAA(2)同（1），填平過(guò)程中，用32pdNTP標(biāo)記DNA片段3’末端。(3)cDNA克隆了中，用于合成cDNA的第二條鏈。(4)在Sanger雙脫氧法ddNTP系統(tǒng)進(jìn)行序列分析。41（三）T7噬菌體DNA聚合酶及測(cè)序酶:1.

T7噬菌體DNA聚合酶

（1）來(lái)源

T7噬菌體感染的E.coli誘生的DNApol是兩種蛋白的復(fù)合物（T7噬菌體基因蛋白和宿主硫氧還原蛋白的緊密復(fù)合體）。（2）

酶的活性

與Klenow片段（酶）相似，有5’－3’聚合活性以及3’－5’外切酶活性，無(wú)5’－3’外切酶活性。①

5’－3’聚合活性其5’－3’聚合能力和合成DNA平均長(zhǎng)度較目前已知的其它任何DNApol都強(qiáng)（持續(xù)聚合能力強(qiáng)）?？捎糜诳截愰L(zhǎng)段模板的引物延伸反應(yīng)。②

3’－5’外切酶活性較Klenow酶強(qiáng)1000倍，其用途與Klenow酶一致，不同的是在于可對(duì)3’突出端的DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記。

2．測(cè)序酶

是經(jīng)過(guò)基因工程改造的T7噬菌體DNApol，它完全喪失了外切酶的活性，故該酶是Sanger雙脫氧法對(duì)長(zhǎng)片段DNA進(jìn)行序列分析的理想用酶（商品名即測(cè)序酶）。

42

（四）TaqDNA聚合酶(TaqDNApol，Taqpol）

該酶是一種耐熱的依賴(lài)于DNA的DNA聚合酶，具有5’－3’聚合活性以及依賴(lài)5’－3’聚合酶作用的外切酶活性，聚合酶的最適反應(yīng)溫度是75℃－80℃,37℃活性有10％。該酶的主要用途是進(jìn)行PCR反應(yīng)（詳參聚合酶鏈，polymerasechainreaction）1.來(lái)源1969年在美國(guó)黃石公園溫泉分離出一種嗜熱真菌，即水生棲熱菌株（thermusaquaticusstrain,TYC），該菌能在70℃－75℃生長(zhǎng)，已經(jīng)克隆化該菌的基因，cetus公司首次分離純化了該酶，商品名為T(mén)aqDNApolymerase，分子量94KD，－20℃至少可貯存6個(gè)月，由于TaqDNApolymerase能抵抗鏈分離所需要的高溫（94℃－95℃）的反復(fù)處理，故只需在第一次熱變性后，加一次酶，即可以進(jìn)行30－40次循環(huán)，簡(jiǎn)化加快了操作程序，實(shí)現(xiàn)了PCR的自動(dòng)化，耐熱酶還有VENT、sac等，以Taq應(yīng)用最廣。

43

2.使用Taqpol主要考慮下述5個(gè)參數(shù)（PCR）

（1）熱穩(wěn)定性PCRcycle中，DNA變性處理通常30－60秒，按30個(gè)循環(huán)累計(jì)熱變性時(shí)間為15－30分鐘，Taqpol連續(xù)保溫30分鐘后，仍保持相對(duì)高的活力。（2）特異性退火（復(fù)性）和延伸的溫控對(duì)引物模板的轉(zhuǎn)移性影響很大。Taqpol最是反應(yīng)溫度是75℃左右，而退火溫度可在55－70℃，因而Taqpol可顯著提高引物退火特異性，避免了引物與模板非特異性產(chǎn)物的合成。（3）延伸長(zhǎng)度PCR有時(shí)需要擴(kuò)增>1kb的片段，這就要求選用DNApol具有較強(qiáng)的延伸能力。當(dāng)擴(kuò)增片段>250bp時(shí)，使用Klenow片段時(shí)的擴(kuò)增率大為降低，而Taqpol能從基因組擴(kuò)增2kb片段。44（4）合成產(chǎn)率高

據(jù)酶反應(yīng)動(dòng)力規(guī)律，聚合反應(yīng)后期會(huì)產(chǎn)生平臺(tái)效應(yīng)，平臺(tái)期出現(xiàn)時(shí)，合成產(chǎn)物積累多少，直接與DNApol的性能有關(guān)。用Taqpol平臺(tái)期在25輪循環(huán)時(shí)出現(xiàn)，產(chǎn)物累計(jì)達(dá)1×107拷貝，高于Klenow片段。（5）忠實(shí)性

評(píng)價(jià)一個(gè)DNApol的忠實(shí)性在于檢測(cè)復(fù)制過(guò)程中核苷酸錯(cuò)誤摻入的頻率，酶的忠實(shí)性是一個(gè)關(guān)鍵特性，尤其是PCR擴(kuò)增物進(jìn)行DNA序列分析時(shí)就顯得尤為重要。Klenow片段錯(cuò)誤頻率約為1/10000,Taqpol約為1/5000，實(shí)際應(yīng)用中，Taqpol經(jīng)過(guò)25輪循環(huán)中，延伸產(chǎn)物的任何位點(diǎn)將在400堿基中出現(xiàn)一個(gè)分子篡改原始序列。目前已發(fā)現(xiàn)T4DNApol的忠實(shí)性較上二者好，其堿基錯(cuò)誤摻入頻率<107。現(xiàn)國(guó)外已建立Taq酶克隆菌株，能改進(jìn)上述性能，增加產(chǎn)量，提高產(chǎn)率。

45（五）

T4噬菌體DNA聚合酶（T4DNApol）1.來(lái)源

源于T4噬菌體感染的E.coli。2.酶的活性，相似于Klenow片段，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于Klenow片段（1）5ˊ→3ˊ聚合活性（2）3ˊ→5ˊ外切酶活性（T4pol/Klenow）

3.基因工程中用途與Klenow片段一致（參前，標(biāo)記末端，填平5’末端），不同的是可對(duì)3’突出端的DNA分子進(jìn)行標(biāo)記。這是用其強(qiáng)勁的3ˊ→5ˊ外切酶活性切除3’突出端，產(chǎn)生3’凹端。

5’－CTGCCTGCA—3’T4DNApol5’－CTG5’-CTACC3’-GACGG32P-dCtp,dNtp3’－GACGG3’-GACGG46五．核酸酶

常用的的單鏈特異的SI核酸酶（核酸酶SI,nucleaseSI，SI）和BAL31。（一）核酸酶SI(SI核酸酶，nucleaseSI，SI，常用的核酸酶)

1.來(lái)源源于米曲霉素（aspergillusoryzas）2.酶作用底物ssDNA、ssRNA、dsDNA、或DNA-RNA雜交鏈。3.酶活性有低、中、極高3種情況變化－(1)降解ssDNA或ssRNA形成5’p末端的單或寡核苷酸，對(duì)DNA活性強(qiáng)于>RNA,如：ssDNA或ssRNASI，PH4,5Zn2＋5ˊpdN或5ˊprN(2)中量SI可從切口（Nick）或小缺口（smallgaps）處降解dsDNA47五．核酸酶

常用的的單鏈特異的SI核酸酶（核酸酶SI,nucleaseSI，SI）和BAL31。（一）核酸酶SI(SI核酸酶，nucleaseSI，SI，常用的核酸酶)3.酶活性有低、中、極高3種情況變化－(3)極大量的SI才能講解dsDNA或DNA-RNA雜交鏈，原因是后者對(duì)SI講解有抗性，所以SI又稱(chēng)單鏈特異的核酸酶。在基因工程中用于：①去除DNA片段的粘性末端而產(chǎn)生平端。②打開(kāi)cDNA中的發(fā)夾環(huán)，使其成平端。③分析DNA：RNA雜交體結(jié)構(gòu)，可證明基因內(nèi)部?jī)?nèi)含子的存在（當(dāng)一條DNA與它的mRNA雜交時(shí)，如果雜交鏈中有RNA－loop環(huán)，SI可切開(kāi)這個(gè)環(huán)，這是基因中有間隔順序證明。48(二)BAL31核酸（源于乳白短桿菌）

1.來(lái)源乳白短桿菌。2.酶活性3’外切核酸酶活性和內(nèi)切核酸酶活性。3.（1）3’外切核酸酶活性：底物平端dsDNA或dsDNA切口；3’－OH突出端或ssDNA；dsRNA。（2）內(nèi)切核酸酶活性：DNA的單鏈區(qū)；底物DNA螺旋構(gòu)象有所改變的雙鏈區(qū)。4．基因工程用于：（1）通過(guò)可控方式去除dsDNA末端的核苷酸→用于基因克隆表達(dá)、缺失突變等。（2）與限制酶協(xié)作→建立物理圖譜。（3）確定DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)→如z－DNA與b-DNA的結(jié)合部位等。

49六、末端轉(zhuǎn)移酶（TTE）（一）來(lái)源小牛胸腺。是僅存于前淋巴細(xì)胞及淋巴樣細(xì)胞內(nèi)的一種不同尋常的DNApol，催化dNTP加到DNA分子3’－OH末端，也稱(chēng)末端脫氧核苷酰（酸）轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase，TTE）。（二）底物帶3’－OH末端的ssDNA具有延伸3’-OH末端dsDNA或平端dsDNA的作用。（三）酶活性：1.催化一個(gè)單核酸（dNTP）－>加到另一個(gè)DNA分子的3’－OH末端，如：ssDNA－OHTTE，Mg2＋或Mn2＋DNA－pd（N）n＋ppindNTP2.平端或帶延伸3’－OH末端的dsDNA需要Co2＋存在才能作模板，如：dsDNATTECo2＋DNA－pd（N）n＋nppindNTP（四）

基因工程中用于：

1．加一個(gè)互補(bǔ)同源多聚尾－>到載體和cDNA－>造成便于重組的人工粘性末端。2.在32p存在時(shí)，用于標(biāo)記DNA分子的3’末端。50七、堿性磷酸酶（alkalinephoptase,APE）

APE包括BAP（細(xì)菌堿性磷酶和CIP（小腸堿性磷酶）。功用如下：（一）去除DNA、RNA和dNTP的5ˊ磷酸根。（二）去除5ˊ-P，防止DNA片段或載體自身環(huán)化。（三）32p標(biāo)記5ˊ—末端前，先用其去除DNA或RNA上的5ˊ-P。51幾種重要的工具酶的酶學(xué)性質(zhì)及在基因工程中的應(yīng)用酶來(lái)源活性底物輔因子特點(diǎn)用途1.限制酶（Ⅱ）(restrictionendonuclease,restrctionenzymes）微生物400RE/350M內(nèi)切dsDNAMg2＋特異性識(shí)別和切割dsDNA,產(chǎn)生平頭或粘性（5’-3’-）末端1．DNA重組2.組建新質(zhì)粒3.構(gòu)建物理圖譜4.制備探針5.DNA序列分析6.分子雜交2.連接酶（ligase）T4phage連接兩個(gè)片段dsDNAMg2+ATP活力：粘端>平端1．DNA重組2.DNA序列分析3.DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）E.coli5’－3’聚合；3’-5’外切；5’-3’外切ssDNAdsDNAdsDNAssDNAMg2＋對(duì)dsDNA外切活性可被5’－3’pol活性所1.制備探針2.DNA序列分析52酶來(lái)源活性底物輔因子特點(diǎn)用途4.逆轉(zhuǎn)錄酶（ReverseTranscription）RNA腫瘤病毒RNA→cDNA；DNA→DNARNAseH解旋ssRNAssDNARNA:DNAcccDNAMg2＋RNA指導(dǎo)DNA指導(dǎo)解超螺旋制備cDNA5.SI核酸酶（NaseSI）米曲霉切單鏈ssDNAssRNAZn2＋切除單鏈切尾巴，產(chǎn)生平端，用于質(zhì)粒組建和DNA重組6.Bal31乳白短桿菌外切dsDNACa2＋5’3’兩端同時(shí)籌速外切7.末端轉(zhuǎn)移酶（TTE）小牛胸腺加dNTP到DNA分子3’－OH末端dsDNAorssDNA3’-OHMg2＋Co2＋存在可具有延伸3’－OH的DNA為模板造成人工粘端，便于重組；32p標(biāo)記DNA分子3’末端8.BIP/CIP細(xì)菌/牛腸切除磷酸ds,ssCa2＋Mg2＋阻斷片段或載體自身環(huán)化。53第三節(jié)載體一．載體的概念：

1.要把一個(gè)有用的基因（目的基因——研究或應(yīng)用基因）通過(guò)基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載體（vector）。

2.凡來(lái)源于質(zhì)?；蚴删w的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段統(tǒng)稱(chēng)為vector。3.基因工程所用的vector實(shí)際上是DNA分子，是用來(lái)攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA54二、載體的分類(lèi)分類(lèi)依據(jù)類(lèi)別克隆擴(kuò)增或表達(dá)舉例1.按功能分成（1）克隆載體（2）表達(dá)載體√√PBR322PCDN32.按進(jìn)入受體細(xì)胞類(lèi)型分（1）原核載體（2）真核載體（3）穿梭載體PUC8PBUDCE41YE3.按載體來(lái)源分病毒載體＋4.按克隆片段得大小（克隆能力）分(1)<1kb(2)<10kb(3)<22kb(4)<50kb(5)0.1-0.4Mb(6)0.5-2Mb(1)M13(2)plasmid(3)λphage(4)casmid(5)BAC(6)YAC√55說(shuō)明：1.穿梭載體（sbuttlevector）

指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，因而可以運(yùn)載目的基因（穿梭往返兩種生物之間，如：YEP,DIDB2192.YAC

YeastArtificialChromsome由酵母基因和PBR322質(zhì)粒衍生物構(gòu)成，對(duì)克隆大的真核基因十分有用，在HGP中發(fā)揮主要作用。3.BAC

細(xì)菌人工染色體。56三、基因工程載體的3個(gè)特點(diǎn)：（一）都能獨(dú)立自主的復(fù)制

載體DNA分子中有一段不影響它們擴(kuò)增的非必需區(qū)域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被動(dòng)的跟著載體一起復(fù)制/擴(kuò)增，就像載體的正常成分一樣。（二）都能便利的加以檢測(cè)

如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細(xì)胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細(xì)胞才能存活。（三）都能容易進(jìn)入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來(lái)。

57四、克隆載體和表達(dá)載體：

所有的載體可以分成兩大類(lèi)：克隆載體和表達(dá)載體。其中最常用的是質(zhì)粒載體。（一）概念：1.克隆載體（cloningvector）

都有一個(gè)松弛的復(fù)制子，能帶動(dòng)外源基因，在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增。它是用來(lái)克隆和擴(kuò)增DNA片段（基因）的載體。2.表達(dá)載體（Expressionvector）

具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。為了有效的轉(zhuǎn)錄，必需有強(qiáng)大的能夠被宿主細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子，為了實(shí)現(xiàn)翻譯，克隆基因必需有合適的SDs和RbS。這樣一個(gè)基因表達(dá)需要的具有表達(dá)和調(diào)控能力的載體稱(chēng)表達(dá)載體。58（二）載體的元件及性質(zhì)

克隆載體ori→Amp→Mcs

E.coli表達(dá)載體元件P→Rbs/SDs→Mcs→terms

真核表達(dá)元件P/E→Mcs→terms→加poly（A）信號(hào)克隆載體元件以及性質(zhì)E．coli表達(dá)載體哺乳動(dòng)物質(zhì)粒細(xì)胞表達(dá)載體1.Ori能在受體細(xì)胞中復(fù)制，含有復(fù)制位點(diǎn)（起點(diǎn)）2.Ampr

抗生素抗性基因可以便利加以檢測(cè)3.MCS多克隆位點(diǎn)，克隆攜帶外源基因片段4.載體可導(dǎo)入宿主細(xì)胞（生物學(xué)/非生物學(xué)方法）1.Ori2.Ampr3.Mcs4.Promoter5.SDsRbs6.Terms7.可導(dǎo)入E.coli1.orip在E.coli中能作復(fù)制起始位點(diǎn)2.Ampr細(xì)菌抗生素抗性基因3.Kanr真核細(xì)胞（哺乳類(lèi)）藥物抗性基因4.Orie真核細(xì)胞復(fù)制起始位點(diǎn)5.Mcs多克隆位點(diǎn)6.P/E啟動(dòng)子/增強(qiáng)子7.Terms終止信號(hào)8.加poly（A）信號(hào)9.可導(dǎo)入真核細(xì)胞（哺乳類(lèi)）（7－8別為轉(zhuǎn)錄翻譯終止密碼，真核細(xì)胞表達(dá)元件。）59（三）元件的類(lèi)別和質(zhì)量：基因工程前考慮的4個(gè)問(wèn)題：

(1)基因工程的目的克隆擴(kuò)增/表達(dá):①生產(chǎn)產(chǎn)品②基因治療(2)克隆片段的大小運(yùn)載多大重量的車(chē)子。(3)受體細(xì)胞類(lèi)型真核/原核/穿梭。(4)載體本身及其元件的質(zhì)量不能搞成“豆腐渣工程”，如P要“強(qiáng)大陣容”。601.Ori－復(fù)制起始點(diǎn)（origin，ori）（1）決定質(zhì)粒自我增殖和拷貝數(shù)的主要元件。（2）使繁殖后細(xì)胞維持一定量的拷貝數(shù)。（3）一般情況下，一個(gè)質(zhì)粒只含一個(gè)ori，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子。（4）穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物2個(gè)復(fù)制子，以確保兩類(lèi)細(xì)胞中都能擴(kuò)增。（5）基因工程使用松弛復(fù)制子，以獲得更多的基因產(chǎn)品。

復(fù)制子是一段包括復(fù)制起始位點(diǎn)，反式因子作用在內(nèi)的DNA片段，其功能是通過(guò)復(fù)制使質(zhì)粒能穩(wěn)定存在宿主菌內(nèi)（如E.coli）。松弛復(fù)制子的特點(diǎn)①拷貝數(shù)多，10－200個(gè)，分子量小。②復(fù)制不受宿主細(xì)菌復(fù)制系統(tǒng)的限制，僅需DDDPI，當(dāng)宿主蛋白質(zhì)合成受到抑制（如培養(yǎng)中加入氯霉素時(shí)）其拷貝數(shù)猛增至1000－3000之多，該性質(zhì)多基因工程技術(shù)十分有利。③分子量小，不具備自傳遞能力。④基因工程使用松弛型質(zhì)粒，如含PBMI復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒。612.抗生素抗性基因：（genotype）編碼產(chǎn)物功能（phenotype）（1）Ampr酶水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。（2）tetr1個(gè)膜蛋白可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。（3）camr乙酰轉(zhuǎn)乙酶生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418（長(zhǎng)那霉素衍生物）失活（5）hygr潮霉素β磷酸轉(zhuǎn)移酶使潮霉素β失活。623.

MCS——多克隆位點(diǎn)（multiplecloiningsite，MCS）（1）MCS

是多個(gè)限制酶識(shí)別的一段DNA順序，以便克隆/插入外源基因/DNA片段，與之相關(guān)概念有：（2）多聚接頭（polyliker）有些質(zhì)粒載體單一切點(diǎn)少，不能普遍使用。為了擴(kuò)大使用范圍，可以加一段有許多限制酶識(shí)別的單一切點(diǎn)的多聚接頭。（3）人工接頭（linker）

是用若干個(gè)bp組成的dsDNA片段，一般有一個(gè)或以上限制酶識(shí)別與切割的順序。(2)與（3）已經(jīng)商品化，注意liker與adaptor的區(qū)別（下述）634，啟動(dòng)子（pormoter）（1）概念：

①促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA順序，又稱(chēng)啟動(dòng)基因或啟動(dòng)序列。

②這個(gè)DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游（up－stream），RNApol結(jié)合在上面，指導(dǎo)酶朝向正確的轉(zhuǎn)錄位置。③啟動(dòng)子又稱(chēng)啟動(dòng)基因，是DNA分子上可以與RNApol特異性結(jié)合并使之開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。④DNA分子一個(gè)與啟動(dòng)子基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)的區(qū)域，包括RNApol識(shí)別，結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始3個(gè)功能部位。64（2）原核生物啟動(dòng)子和真核生物啟動(dòng)子的比較啟動(dòng)子功能性質(zhì)：①?zèng)Q定轉(zhuǎn)錄方向，啟動(dòng)啟動(dòng)下游（down－stream）基因互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄mRNA與信息鏈一致。②決定dsDNA的哪一條鏈作為模板，轉(zhuǎn)錄出RNA。③決定轉(zhuǎn)錄效率，強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率強(qiáng)，弱次之。④啟動(dòng)子是可以接受調(diào)控的，可以被改造的。原核生物E.coli啟動(dòng)子長(zhǎng)約40－60bp真核生物啟動(dòng)子識(shí)別位點(diǎn)－35bp（α2ββσ）TATA因子（TFⅡD）先結(jié)合TATAbox，再結(jié)合RNApol結(jié)合位點(diǎn)－10bp（即TATA合）－25bp，富含AT稱(chēng)為T(mén)ATA合或Hogness合，與RNApolⅡ結(jié)合。起始位點(diǎn)＋1－＋20bp＋1bp，轉(zhuǎn)錄合成RNA第一個(gè)bp的位置（同左）65（3）基因工程中常使用強(qiáng)啟動(dòng)子

表達(dá)系統(tǒng)常用啟動(dòng)子及備注1.Ecoli（1）Lacuv5（乳糖uv5啟動(dòng)子）（2）trp（色氨酸啟動(dòng)子）（3）Tac（乳糖色氨酸雜合啟動(dòng)子）（4）λPL（λphage左向啟動(dòng)子，包括CI857ts阻遏子）2.酵母（1）己醇脫氨酶啟動(dòng)子（2）酸性磷酸酶啟動(dòng)子3.哺乳動(dòng)物細(xì)胞（1）SV40啟動(dòng)子（帶有增強(qiáng)子）(2)腺病毒晚期啟動(dòng)子（3）Melallothionen基因啟動(dòng)子4.昆蟲(chóng)細(xì)胞（1）多角蛋白基因啟動(dòng)子（2）10K蛋白基因啟動(dòng)子5.植物（1）花葉菜花葉病毒啟動(dòng)子（2）Napalin合成酶啟動(dòng)子（3）微蛋白啟動(dòng)子。（Tubulin）66用于原核表達(dá)系統(tǒng)的強(qiáng)啟動(dòng)子①Lac→②Lacuv5→③Trp→④Tac→⑤λPL→⑥T7

名稱(chēng)來(lái)源組成正調(diào)控負(fù)調(diào)控備注1．LacE.coli乳糖操縱子（1）Pg（啟動(dòng)基因）；（2）CAP（降解物激活蛋白基因）；（3）O（操縱子）；（4）S（部分β－半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)基因）。分解代謝系統(tǒng)：CAP－cAMP－>激活P（啟動(dòng)子）－>促進(jìn)轉(zhuǎn)錄阻遏物－R調(diào)節(jié)基因R編碼產(chǎn)物產(chǎn)生阻遏蛋白－>結(jié)合在O上（操縱基因）－>阻止轉(zhuǎn)錄存在乳糖時(shí)－>乳糖－>結(jié)合阻遏蛋白－>解除對(duì)轉(zhuǎn)錄阻遏－>開(kāi)始轉(zhuǎn)錄2．Lac－uv5是一個(gè)突變?nèi)樘遣倏v子IPIG是β－半乳糖苷酶底物類(lèi)似物－>它能與阻遏蛋白結(jié)合－>使O成游離狀態(tài)對(duì)分解代謝抑制不敏感－>即使沒(méi)有CAP－cAMP－>轉(zhuǎn)錄照常進(jìn)行據(jù)報(bào)首Lac組建載體在原核細(xì)胞表達(dá)時(shí)IPTG可提高真核基因表達(dá)水平50倍。67名稱(chēng)來(lái)源組成正調(diào)控負(fù)調(diào)控備注3．Trp從E.coli色氨酸操縱子分離（1）Pg（啟動(dòng)基因）；（2）R（制動(dòng)基因）；（3）O（操縱基因）；（4）SE（色氨酸Trp部分結(jié)構(gòu)基因）。β－吲哚丙烯酸是Trp的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑－>它能與阻遏蛋白結(jié)合－>阻止了Trp與之結(jié)合而活化－>使轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生阻遏蛋白，結(jié)合Trp有活性－>再結(jié)合在O上阻止轉(zhuǎn)錄－>缺乏Trp－>阻遏蛋白不能活化－>去阻遏據(jù)報(bào)道β－吲哚丙烯酸在轉(zhuǎn)錄水平至少可以增強(qiáng)50倍↑，另外制動(dòng)基因缺乏可提高轉(zhuǎn)錄水平↑8－10倍4．Tac（Trp－Lac）人工構(gòu)建的Trp＋Lac雜合啟動(dòng)子（1）tacⅠ=Trp-35+Lac－uv5-20；（2）tacⅡ＝Trp-35＋一個(gè)合成的46bp片段；包括pribrow合和LacO（3）tac12＝Trp－35＋Lac－10區(qū)，操縱基因O部分，SD順序融合而成。IPIG誘導(dǎo)受Lac阻遏物的調(diào)控（1）比Lacuv5強(qiáng)7倍；（2）受體菌有RB791，XL－blue，SB221，JM109等。5.T7噬菌體啟動(dòng)子帶有Lacuv5啟動(dòng)子控制的T7噬菌體RNApol基因IPIG誘導(dǎo)（1）比Lacuv5強(qiáng)7倍；（2）受體菌有RB791，XL－blue，SB221，JM109等。685.增強(qiáng)子/沉默子（enhancer，E/silencer（negatireenhancer）

（1）概念為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無(wú)關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。（2）增強(qiáng)子的作用特點(diǎn)①可在基因的5’或3’端發(fā)揮作用，一般在5’端轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游－100至－300bp處。②

不受序列方向制約；③

通過(guò)增強(qiáng)啟動(dòng)子發(fā)揮作用。（3）增強(qiáng)子的作用機(jī)制：①

改變DNA的螺旋結(jié)構(gòu)，使其成柔曲線(xiàn)－>拉近E/P距離；②

為DNA模板提供某一特定空間微環(huán)境－>促進(jìn)top異構(gòu)酶改變DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)；③

為RNApol和反式作用因子提供一個(gè)與順式元件聯(lián)系的結(jié)構(gòu)。如增強(qiáng)子的荃環(huán)利于與反式因子結(jié)合。696.

核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）

mRNA有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于原核而言是AUG（起始密碼）和SD序列（位于A(yíng)UG上游3－11bp處由3－9bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16sRNA富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是RNA識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)。由于J.shine－LDagarne（1974）首先發(fā)現(xiàn)，故名。

mRNA5’AGGAGG－UUGACCU－AUG3’AUCCUCC－UAG,rRNA的3’末端（1）翻譯水平的調(diào)控是不嚴(yán)格的，只有mRNA/Rbs結(jié)合才是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵。（Rbs是E.coli表達(dá)載體必不可少的元件）。（2）不同的啟動(dòng)子表達(dá)一種pr.時(shí)，SD－AUG之間的距離可能是不一樣的，在試圖提高表達(dá)效率，SD－AUG之間的距離是重視的因素之一。707．轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子（terminatorotranscrition，termterminatoroftranslation,terminator

codon,stopcodon）：

（1）轉(zhuǎn)錄終止子/term

指一個(gè)基因編碼區(qū)downstream的DNA順序，可被RNApol識(shí)別為停止合成mRNA的信號(hào)。原核生物中，在轉(zhuǎn)錄部分末端term常有一個(gè)IR和緊接著的一小段，基因轉(zhuǎn)錄部分之外可能還有影響轉(zhuǎn)錄終止的順序。值得注意的是：①有些載體不含終止序列，表達(dá)外源蛋白質(zhì)時(shí)也可獲得較滿(mǎn)意的結(jié)果（基因轉(zhuǎn)錄之外順序可影響轉(zhuǎn)錄終止）；②多數(shù)外源蛋白質(zhì)表達(dá)載體帶有合適的終止順序；③轉(zhuǎn)錄終止順序有長(zhǎng)有短，短的長(zhǎng)約700－800bp。（2）翻譯終止密碼子/terminatorcodon

mRNA種三個(gè)核苷酸順序可終止蛋白質(zhì)的合成，有3種終止碼：UAA（赫石型）UAG（琥珀型）和UAG（空白型）（參nonsensemutationsupperessor。）718．加poly（A）尾信號(hào)

結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè)AATAAA的保守序列，此位點(diǎn)down－stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號(hào)。mRNA轉(zhuǎn)錄到此后，產(chǎn)生AAUAAA和隨后的GU或U豐富區(qū)，與RNApol結(jié)合的延長(zhǎng)因子，可以識(shí)別這種結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合，然后在A(yíng)AUAAA下游10－30bp的部位切斷RNA，并加上poly（A）尾。

關(guān)于7和8，至今，對(duì)真核轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)/終止機(jī)制了解不多,主要困難是難以確定原初轉(zhuǎn)錄物的3’末端，因?yàn)榇蠖鄶?shù)基因轉(zhuǎn)錄后很快進(jìn)行加工?，F(xiàn)在基因工程表達(dá)載體使用的轉(zhuǎn)錄終止子都是病毒基因或細(xì)胞基因3’端的一段序列，其中包括3’不翻譯區(qū)，終止位點(diǎn)和poly(A)位點(diǎn)（整段照搬）。72第四節(jié)重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程

基因工程包括3個(gè)步驟：1．

DNA重組2．

重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞－克隆擴(kuò)增或表達(dá)3．

基因工程的后處理（down－streamtechniquesofGE）重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程：1．

載體的選擇和制備——分；2．

制備目的基因片段——切；3．

DNA片段的重組連接——接；4．

重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞——轉(zhuǎn)；5．

轉(zhuǎn)化子的篩選——篩；6．

重組子的篩選——篩；7．

重組子的鑒定——鑒；8．

克隆擴(kuò)增或表達(dá)——擴(kuò)/表達(dá)；9．

基因工程的后處理——分。73(xbalI)EcoRIEcoRI(HindIII)PUC(xbalI)EcoRI(HindIII)EcoRIEcoRI+EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIDigestionwithEcoRIRecoveryofAPPAIDNAframagaroseAPOAIPUCQ-APOAIPBR325-APOAIPUC9PUC9APOAIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIFigure2strategyofconstructionofrecombinantpucq-APOAIplasmiaE.coli74PreparationofPBR325—APOAIandPHCoplasmidDigestionofPBR325-APOAIwithEcoRIDiestionofPucowithEcoRIIsolationandRecoveryofAPOAIgenefragmentLabelingofDNAprobewithisotopeorbiotinLigationTransformationofEcoliSelectionofTransformantsIdentificationofplasmidplasmidbyenzymedigestionIdentificationofrecombinatnDNAbysouthernhybridizationFigure3TheexperimentalprocessoftheconstructionofrecombinantDNA75一、基因工程載體及其選用/制備/獲取/構(gòu)建：

載體是基因工程技術(shù)的核心，沒(méi)有合適的載體，外源基因很難進(jìn)入受體細(xì)胞，即使能夠進(jìn)入，一般也不能進(jìn)行復(fù)制或表達(dá)。有了合適的載體與目的基因體外重組，宿主細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)，即可獲得大量的基因片段或蛋白質(zhì)產(chǎn)物。（一）

載體的選擇：載體選擇主要考慮下述3點(diǎn)：1.構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。2.載體的類(lèi)型：（1）克隆載體的克隆能力－據(jù)克隆片段大?。ù筮x大，小選?。Ｈ?lt;10kb選質(zhì)粒。（2）表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類(lèi)型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體。76

（3）對(duì)原核表達(dá)載體應(yīng)該注意3點(diǎn)：

①選擇合適的啟動(dòng)子及相應(yīng)的受體菌；②用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服4個(gè)困難和閱讀框錯(cuò)位；③表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。

3.載體MCS中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。選用質(zhì)粒（最常用）做載體的4點(diǎn)要求：

①選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；②一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般10個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè)。③必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地；④必需有易檢測(cè)的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（試一試）。77（二）載體的制備（以質(zhì)粒載體為例）：

質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的cccDNA分子，操作步驟簡(jiǎn)述如下：