第四講發(fā)酵工藝控制演示文稿

第四講發(fā)酵工藝控制演示文稿當前1頁，總共123頁。（優(yōu)選）第四講發(fā)酵工藝控制當前2頁，總共123頁。4.1發(fā)酵過程的分類

分批培養(yǎng)補料分批培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)當前3頁，總共123頁。典型的微生物生長曲線

初級代謝產(chǎn)物，在對數(shù)生長期初期就開始合成并積累次級代謝產(chǎn)物，在對數(shù)生長期后期和穩(wěn)定期大量合成當前4頁，總共123頁。4.1.1分批發(fā)酵

簡單的過程，培養(yǎng)基中接入菌種以后，沒有物料的加入和取出，除了空氣的通入和排氣。整個過程中菌的濃度、營養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)都隨時間變化。分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點

優(yōu)點:操作簡單，周期短，染菌機會少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握缺點:產(chǎn)率低，不適于測定動力學數(shù)據(jù)當前5頁，總共123頁。4.1.2補料分批培養(yǎng)

在分批培養(yǎng)過程中補入新鮮的料液，以克服營養(yǎng)不足而導致的發(fā)酵過早結(jié)束的缺點。在此過程中只有料液的加入沒有料液的取出，所以發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液體積比發(fā)酵開始時有所增加。在工廠的實際生產(chǎn)中采用這種方法很多。當前6頁，總共123頁。補料分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點:在這樣一種系統(tǒng)中可以維持低的基質(zhì)濃度，避免快速利用碳源的阻遏效應；可以通過補料控制達到最佳的生長和產(chǎn)物合成條件；還可以利用計算機控制合理的補料速率，穩(wěn)定最佳生產(chǎn)工藝。缺點:由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導致比生產(chǎn)速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌機會.當前7頁，總共123頁。4.1.3半連續(xù)培養(yǎng)

在補料分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上間歇放掉部分發(fā)酵液稱為半連續(xù)培養(yǎng)。如四環(huán)素發(fā)酵；

優(yōu)點:放掉部分發(fā)酵液，再補入部分料液，使代謝有害物得以稀釋有利于產(chǎn)物合成，提高了總產(chǎn)量。

缺點:代謝產(chǎn)生的前體物被稀釋，提取的總體積增大當前8頁，總共123頁。4.1.4連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵過程中一邊補入新鮮料液一邊放出等量的發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)的體積維持恒定。達到穩(wěn)態(tài)后，整個過程中菌的濃度，產(chǎn)物濃度，限制性基質(zhì)濃度都是恒定的。當前9頁，總共123頁。連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點

優(yōu)點:控制稀釋速率可以使發(fā)酵過程最優(yōu)化。發(fā)酵周期長，得到高的產(chǎn)量。由于μ＝D，通過改變稀釋速率可以比較容易的研究菌生長的動力學；

缺點:若菌種不穩(wěn)定，長期連續(xù)培養(yǎng)會引起菌種退化，降低產(chǎn)量。長時間補料染菌機會大大增加。當前10頁，總共123頁。

發(fā)酵過程工藝控制目的

有一個好的菌種以后要有一個配合菌種生長的最佳條件，使菌種的潛能發(fā)揮出來，目標是得到最大的比生產(chǎn)速率和最大的生產(chǎn)率；4.2發(fā)酵工藝控制發(fā)揮菌種的最大生產(chǎn)潛力考慮之點菌種本身的代謝特點生長速率、呼吸強度、營養(yǎng)要求（酶系統(tǒng)）、代謝速率菌代謝與環(huán)境的相關(guān)性溫度、pH、滲透壓、離子強度、溶氧濃度、剪切力等當前11頁，總共123頁。發(fā)酵過程的中間分析

發(fā)酵過程的中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛，它顯示了發(fā)酵過程中微生物的主要代謝變化。因為微生物個體極微小，肉眼無法看見，要了解它的代謝狀況，只能從分析一些參數(shù)來判斷，所以說中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛。這些代謝參數(shù)又稱為狀態(tài)參數(shù)，因為它們反映發(fā)酵過程中菌的生理代謝狀況，如pH，溶氧，尾氣氧，尾氣二氧化碳，粘度，菌濃度等當前12頁，總共123頁。參數(shù)分類按參數(shù)性質(zhì)分：物理參數(shù)：溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、空氣壓力、空氣流量、溶解氧、表觀粘度、尾氣氧（二氧化碳）濃度等；化學參數(shù)：基質(zhì)濃度（包括糖、氮、磷）、pH、產(chǎn)物濃度、核酸量等；生物參數(shù)：菌絲形態(tài)、菌濃度、菌體比生長速率、呼吸強度、基質(zhì)消耗速率、關(guān)鍵酶活力等；當前13頁，總共123頁。按檢測手段分：直接參數(shù)、間接參數(shù)直接參數(shù)：通過儀器或其它分析手段可以測得的參

數(shù)，如溫度、pH、殘?zhí)堑龋环譃樵诰€

檢測參數(shù)和離線檢測參數(shù)；間接參數(shù)：將直接參數(shù)經(jīng)過計算得到的參數(shù)，如攝

氧率、KLa等；當前14頁，總共123頁。4.2.1溫度對發(fā)酵的影響及其控制

一、溫度對生長的影響

不同微生物的生長對溫度的要求不同，根據(jù)它們對溫度的要求大致可分為四類：嗜冷菌適應于0～26℃生長，嗜溫菌適應于15～43℃生長，嗜熱菌適應于37～65℃生長，嗜高溫菌適應于65℃以上生長當前15頁，總共123頁。

每種微生物對溫度的要求可用最適溫度、最高溫度、最低溫度來表征。在最適溫度下，微生物生長迅速；超過最高溫度微生物即受到抑制或死亡；在最低溫度范圍內(nèi)微生物尚能生長，但生長速度非常緩慢，世代時間無限延長。在最低和最高溫度之間，微生物的生長速率隨溫度升高而增加，超過最適溫度后，隨溫度升高，生長速率下降，最后停止生長，引起死亡。

微生物受高溫的傷害比低溫的傷害大，即超過最高溫度，微生物很快死亡；低于最低溫度，微生物代謝受到很大抑制，并不馬上死亡。這就是菌種保藏的原理。當前16頁，總共123頁。二、溫度的影響與控制（一）溫度對發(fā)酵的影響1、溫度影響反應速率發(fā)酵過程的反應速率實際是酶反應速率，酶反應有一個最適溫度。從阿累尼烏斯方程式可以看到dlnKr/dt=E/RT2

積分得

E=E——活化能Kr——速率常數(shù)當前17頁，總共123頁。2、溫度影響發(fā)酵方向

四環(huán)素產(chǎn)生菌金色鏈霉菌同時產(chǎn)生金霉素和四環(huán)素，當溫度低于300C時，這種菌合成金霉素能力較強；溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高，溫度達到350C時，金霉素的合成幾乎停止，只產(chǎn)生四環(huán)素。溫度還影響基質(zhì)溶解度，氧在發(fā)酵液中的溶解度也影響菌對某些基質(zhì)的分解吸收。因此對發(fā)酵過程中的溫度要嚴格控制。當前18頁，總共123頁。（二）最適溫度的選擇1、根據(jù)菌種及生長階段選擇

微生物種類不同，所具有的酶系及其性質(zhì)不同，所要求的溫度范圍也不同。黑曲霉生長溫度為37℃，谷氨酸產(chǎn)生菌棒狀桿菌的生長溫度為30～32℃，青霉菌生長溫度為30℃。當前19頁，總共123頁。

發(fā)酵前期由于菌量少，要盡快達到大量的菌體，取稍高的溫度，促使菌的呼吸與代謝，使菌生長迅速；

發(fā)酵中期菌量已達到合成產(chǎn)物的最適量，發(fā)酵需要延長中期，從而提高產(chǎn)量，因此中期溫度要稍低一些，可以推遲衰老。因為在稍低溫度下氨基酸合成蛋白質(zhì)和核酸的正常途徑關(guān)閉得比較嚴密有利于產(chǎn)物合成。

發(fā)酵后期，產(chǎn)物合成能力降低，延長發(fā)酵周期沒有必要，就又提高溫度，刺激產(chǎn)物合成到放罐。如四環(huán)素生長階段28℃，合成期260C℃后期再升溫；黑曲霉生長37℃，產(chǎn)糖化酶32～34℃。但也有的菌種產(chǎn)物形成比生長溫度高。如谷氨酸產(chǎn)生菌生長30～32℃，產(chǎn)酸34～37℃。根據(jù)生長階段選擇當前20頁，總共123頁。實例：林可霉素發(fā)酵的變溫培養(yǎng)

發(fā)酵現(xiàn)象接種后10h左右已進入對數(shù)生長期，隨后是10h左右的加速生長期，在40h左右對數(shù)生長期基本完成，在50h左右轉(zhuǎn)入生產(chǎn)期；主要問題

如何維持適度的菌體濃度和延長分泌期？適當降低培養(yǎng)溫度可以延緩菌體的衰老和維持相當數(shù)量的有強生產(chǎn)能力的菌絲體存在！當前21頁，總共123頁。變溫培養(yǎng)的正交設計當前22頁，總共123頁。當前23頁，總共123頁。分析結(jié)論：前60h按31℃控制，縮短了適應期使發(fā)酵提前轉(zhuǎn)入生產(chǎn)階段，同時菌絲體已有相當量的積累，為大量分泌抗生素提供了物質(zhì)基礎(chǔ)；60小時后將罐溫降至3O℃使與抗生素合成有關(guān)的酶的活性增強，抗生素分泌量有所增加，同時因分泌期的延長有利于進一步積累抗生素；發(fā)酵進入后期罐溫再回升至31℃使生產(chǎn)菌在生命的最后階段最大限度的合成和排出次級代謝產(chǎn)物。當前24頁，總共123頁。2、根據(jù)培養(yǎng)條件選擇

溫度選擇還要根據(jù)培養(yǎng)條件綜合考慮，靈活選擇。

通氣條件差時可適當降低溫度，使菌呼吸速率降低些，溶氧濃度也可髙些。

培養(yǎng)基稀薄時，溫度也該低些。因為溫度高營養(yǎng)利用快，會使菌過早自溶。當前25頁，總共123頁。3、根據(jù)菌生長情況

菌生長快，維持在較高溫度時間要短些；菌生長慢，維持較高溫度時間可長些。培養(yǎng)條件適宜，如營養(yǎng)豐富，通氣能滿足，那么前期溫度可髙些，以利于菌的生長?？偟膩碚f，溫度的選擇根據(jù)菌種生長階段及培養(yǎng)條件綜合考慮。要通過反復實踐來定出最適溫度。當前26頁，總共123頁。三、發(fā)酵過程引起溫度變化的因素（一）發(fā)酵熱Q發(fā)酵

發(fā)酵熱：就是發(fā)酵過程中釋放出來的凈熱量。發(fā)酵熱=生物熱＋機械攪拌熱-罐壁散熱-水分蒸發(fā)熱-排氣熱；發(fā)酵熱是引起發(fā)酵過程溫度變化的原因：發(fā)酵熱大，溫度上升快，發(fā)酵熱小，溫度上升慢。當前27頁，總共123頁。1、生物熱Q生物

在發(fā)酵過程中，菌體不斷利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，將其分解氧化而產(chǎn)生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供細胞合成和代謝產(chǎn)物合成需要的能量，其余一部分以熱的形式散發(fā)出來，這散發(fā)出來的熱就叫生物熱。微生物進行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多。當前28頁，總共123頁。

生物熱與發(fā)酵類型有關(guān)微生物進行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多一摩爾葡萄糖徹底氧化成CO2和水好氧：產(chǎn)生287.2千焦耳熱量，

183千焦耳轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芑衔?/p>

104.2千焦以熱的形式釋放厭氧：產(chǎn)生22.6千焦耳熱量，

9.6千焦耳轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芑衔?/p>

13千焦以熱的形式釋放二個例子中轉(zhuǎn)化為高能化合物分別為63.7％和42.6％當前29頁，總共123頁。

培養(yǎng)過程中生物熱的產(chǎn)生具有強烈的時間性生物的大小與呼吸作用強弱有關(guān)在培養(yǎng)初期，菌體處于適應期，菌數(shù)少，呼吸作用緩慢，產(chǎn)生熱量較少。菌體在對數(shù)生長期時，菌體繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌體也較多，所以產(chǎn)生的熱量多，溫度上升快，必須注意控制溫度。培養(yǎng)后期，菌體已基本上停止繁殖，主要靠菌體內(nèi)的酶系進行代謝作用，產(chǎn)生熱量不多，溫度變化不大，且逐漸減弱。如果培養(yǎng)前期溫度上升緩慢，說明菌體代謝緩慢，發(fā)酵不正常。如果發(fā)酵前期溫度上升劇烈，有可能染菌，此外培養(yǎng)基營養(yǎng)越豐富，生物熱也越大。當前30頁，總共123頁。根據(jù)化合物的燃燒值估算發(fā)酵過程生物熱的近似值。因為熱效應決定于系統(tǒng)的初態(tài)和終態(tài)，而與變化途徑無關(guān)，反應的熱效應可以用燃燒值來計算，特別是有機化合物，燃燒熱可以直接測定。反應熱效應等于反應物的燃燒熱總和減去生成物的燃燒熱的總和。ΔH＝∑（△H）反應物－∑（△H）產(chǎn)物如谷氨酸發(fā)酵中主要物質(zhì)的燃燒熱為：葡萄糖159555.9KJ/Kg谷氨酸15449.3KJ/Kg玉米漿12309.2KJ/Kg菌體20934KJ/Kg尿素10634.5KJ/Kg生物熱的測定與計算當前31頁，總共123頁?？筛鶕?jù)實測發(fā)酵過程中物質(zhì)平衡計算生物熱例如某味精廠50M3發(fā)酵罐發(fā)酵過程測定結(jié)果的主要物質(zhì)變化如表：發(fā)酵時間（h）0～66～1212～1818～31葡萄糖－37－30.3－24.0－41.7谷氨酸5.915.423.9尿素－2.9－6.0菌體4.86.01.2玉米漿－2.4－3.0－0.6當前32頁，總共123頁。發(fā)酵12～18小時的生物熱為：Q生物＝24×159555.9＋0.6×12309.2＋6×10634.5－1.2×20934－15.4×15449.3＝191098.1KJ/M3191098.1÷6＝31849.7每小時的生物熱為31849.7KJ/M3當前33頁，總共123頁。2、攪拌熱Q攪拌在機械攪拌通氣發(fā)酵罐中，由于機械攪拌帶動發(fā)酵液作機械運動，造成液體之間，液體與攪拌器等設備之間的摩擦，產(chǎn)生可觀的熱量。攪拌熱與攪拌軸功率有關(guān)，可用下式計算：

Q攪拌＝P×860×4186.8（焦耳/小時）

P——攪拌軸功率

4186.8——機械能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮艿臒峁Ξ斄侩姍C功率P=E——額定電壓I——額定電流cosφ——功率因素，1千瓦時＝860×4186.8焦耳當前34頁，總共123頁。3、蒸發(fā)熱Q蒸發(fā)

通氣時，引起發(fā)酵液的水分蒸發(fā)，水分蒸發(fā)所需的熱量叫蒸發(fā)熱。此外，排氣也會帶走部分熱量叫顯熱Q顯熱，顯熱很小，一般可以忽略不計。4、輻射熱Q輻射發(fā)酵罐內(nèi)溫度與環(huán)境溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過罐體向外輻射。輻射熱的大小取決于罐溫與環(huán)境的溫差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超過發(fā)酵熱的5％。Q發(fā)酵＝Q生物＋Q攪拌－Q蒸發(fā)－Q輻射當前35頁，總共123頁。（二）發(fā)酵熱的測定

一種是用冷卻水進出口溫度差計算發(fā)酵熱。在工廠里，可以通過測量冷卻水進出口的水溫，再從水表上得知每小時冷卻水流量來計算發(fā)酵熱。Q發(fā)酵＝GCm(T出－T進)Cm——水的比熱G——冷卻水流量

另一種是根據(jù)罐溫上升速率來計算。先自控，讓發(fā)酵液達到某一溫度，然后停止加熱或冷卻，使罐溫自然上升或下降，根據(jù)罐溫變化的速率計算出發(fā)酵熱。當前36頁，總共123頁。四、利用溫度控制提高產(chǎn)量例1：利用熱沖擊處理技術(shù)提高發(fā)酵甘油的產(chǎn)量背景：（1）酵母在比常規(guī)發(fā)酵溫度髙10～200C的溫度下經(jīng)受一段時間刺激后，胞內(nèi)海藻糖的含量顯著增加。（2）Lewis發(fā)現(xiàn)熱沖擊能提高細胞對鹽滲透壓的耐受力。（3）Toshiro發(fā)現(xiàn)熱沖擊可使胞內(nèi)3－磷酸甘油脫氫酶的活力提高15～25％，并導致甘油產(chǎn)量提高。當前37頁，總共123頁。實驗：甘油發(fā)酵是在髙滲透壓環(huán)境中進行的，因此可望通過熱沖擊來提高發(fā)酵甘油的產(chǎn)量正交條件A沖擊溫度（℃）40，45，50B開始時機（h）8，16，30C沖擊時間（分）15，30，60結(jié)果發(fā)酵16小時，45℃沖擊30分鐘最佳，發(fā)酵96小時后甘油濃度提高32.6％，發(fā)酵罐實驗見圖（A）16h,45℃,30min（B）12h,45℃,30min當前38頁，總共123頁。A溫度；B開始時機；C沖擊時間當前39頁，總共123頁。當前40頁，總共123頁。A比B好當前41頁，總共123頁。例2：重組大腸桿菌人Cu/Zn-SOD的高表達Lac啟動子，用乳糖作誘導劑

27℃30℃34℃37℃SOD49661427065904638比活8101471679526蛋白6.1299.709.7911.88OD6007.41

10.72

11.7824.77當前42頁，總共123頁。原因分析：1、乳糖被用于合成菌體和其它蛋白，減少了合成SOD

的原料，隨著溫度升高，蛋白和菌濃都增加；2、高溫下可能SOD降解速率增加，雜蛋白增加；3、低溫下由于比生長速率低，質(zhì)粒脫落減少；4、低溫下菌的衰老減緩，死亡率低；當前43頁，總共123頁。4.2.2發(fā)酵過程的pH控制

pH是微生物代謝的綜合反映，又影響代謝的進行，所以是十分重要的參數(shù)。

發(fā)酵過程中pH是不斷變化的，通過觀察pH變化規(guī)律可以了解發(fā)酵的正常與否當前44頁，總共123頁。一、發(fā)酵過程pH變化的原因

1、基質(zhì)代謝

（1）糖代謝特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降；糖缺乏，pH上升，是補料的標志之一（2）氮代謝當氨基酸中的-NH2被利用后pH會下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，當碳源不足時氮源當碳源利用pH上升。（3）生理酸堿性物質(zhì)利用后pH會上升或下降當前45頁，總共123頁。2、產(chǎn)物形成

某些產(chǎn)物本身呈酸性或堿性，使發(fā)酵液pH變化。如有機酸類產(chǎn)生使pH下降，紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性，使pH上升。

3、菌體自溶

pH上升，發(fā)酵后期，pH上升。

當前46頁，總共123頁。二、pH對發(fā)酵的影響

林可霉素發(fā)酵開始，葡萄糖轉(zhuǎn)化為有機酸類中間產(chǎn)物，發(fā)酵液pH下降，待有機酸被生產(chǎn)菌利用，pH上升。若不及時補糖、(NH4)2SO4或酸，發(fā)酵液pH可迅速升到8.0以上，阻礙或抑制某些酶系，使林可霉素增長緩慢，甚至停止。對照罐發(fā)酵66小時pH達7.93，以后維持在8.0以上至115小時，菌絲濃度降低，NH2-N升高，發(fā)酵不再繼續(xù)。發(fā)酵15小時左右，pH值可以從消后的6.5左右下降到5.3，調(diào)節(jié)這一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高發(fā)酵單位。

1、實例1：pH對林可霉素發(fā)酵的影響

當前47頁，總共123頁。pH7.0t不調(diào)pH調(diào)pH效價pH

pH對林可霉素發(fā)酵的影響

當前48頁，總共123頁。例2：培養(yǎng)基初始pH值對漆酶分泌的影響pH在4～7范圍內(nèi)產(chǎn)酶最高當前49頁，總共123頁。2、pH對發(fā)酵的影響

（1）pH影響酶的活性。當pH值抑制菌體某些酶的活性時使菌的新陳代謝受阻；（2）pH值影響微生物細胞膜所帶電荷的改變，從而改變細胞膜的透性，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進行

（3）pH值影響培養(yǎng)基成分和中間代謝物的解離，從而影響微生物對這些物質(zhì)的利用

當前50頁，總共123頁。（4）pH影響代謝方向

pH不同，往往引起菌體代謝過程不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。例如黑曲霉在pH2~3時發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，在pH近中性時，則產(chǎn)生草酸。谷氨酸發(fā)酵，在中性和微堿性條件下積累谷氨酸，在酸性條件下則容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。當前51頁，總共123頁。3、pH在微生物培養(yǎng)的不同階段有不同的影響

生長合成pH對菌體生長影響比產(chǎn)物合成影響小青霉素：菌體生長最適pH3.5~6.0，產(chǎn)物合成最適pH7.2~7.4

四環(huán)素：菌體生長最適pH6.0~6.8，產(chǎn)物合成最適pH5.8~6.0XpH四環(huán)素當前52頁，總共123頁。4、最佳pH的確定

配制不同初始pH的培養(yǎng)基，通過搖瓶考察發(fā)酵情況pH對產(chǎn)海藻酸裂解酶的影響當前53頁，總共123頁。pH對海藻糖水解酶產(chǎn)生的影響當前54頁，總共123頁。pH對谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活力的影響當前55頁，總共123頁。三、pH的控制

1、調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的pH。基礎(chǔ)料中若含有玉米漿，pH呈酸性，必須調(diào)節(jié)pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要調(diào)到6.5~6.82、在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)，如CaCO3

，或具有緩沖能力的試劑，如磷酸緩沖液等當前56頁，總共123頁。

在發(fā)酵過程中根據(jù)糖氮消耗需要進行補料，在補料與調(diào)pH沒有矛盾時采用補料調(diào)pH：如（1）調(diào)節(jié)補糖速率，調(diào)節(jié)空氣流量來調(diào)節(jié)pH

（2）當NH2-N低，pH低時補氨水；當NH2-N低，pH高時補(NH4)2SO44、當補料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時，加酸堿調(diào)pH

3、通過補料調(diào)節(jié)pH

當前57頁，總共123頁。

分別在4種緩沖介質(zhì)中，于pH6．50一9．50測定天冬酰胺酶酶活力．1甘氨酸介質(zhì)pH8.00時酶活力最高；2硼酸在pH8．50，酶反應最快3磷酸在pH8．50，酶反應最快4Tris在pH8．50，酶反應最快酶活1＞2＞4＞35、不同調(diào)pH方法的影響天冬酰胺酶當前58頁，總共123頁。

不同pH控制方式對目的突變株ISw330異亮氨酸搖瓶發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖所示?！?”表示只加CaC03控制pH值，“2”表示只加尿素控制，“3”表示CaC03和尿素聯(lián)合控制pH值。異亮氨酸發(fā)酵當前59頁，總共123頁。例：pH對L-異亮氨酸發(fā)酵的影響菌株最適生長pH控制在6.8～7.06、發(fā)酵的不同階段采取不同的pH值當前60頁，總共123頁。

不同pH值對菌體的形態(tài)影響很大，當pH值高于7．5時，菌體易于老化，呈現(xiàn)球狀；當pH值低于6．5時菌體同樣受抑制，易于老化。而在7．2左右時，菌體是處于產(chǎn)酸期，呈現(xiàn)長的橢圓形；在6．9左右時，菌體處于生長期，呈“八”字形狀并占有絕對的優(yōu)勢。當前61頁，總共123頁。當前62頁，總共123頁。

采用階段pH控制模式進行發(fā)酵，在發(fā)酵中前期控制pH6.9，到48h后pH值為7.15，到80h后pH值為7.25。產(chǎn)率22.27g·/L，產(chǎn)酸率提高12.23％。當前63頁，總共123頁。pH對發(fā)酵的影響pH影響酶的活性pH值影響微生物細胞膜所帶電荷的改變pH值影響培養(yǎng)基成分和中間代謝物的解離pH影響代謝方向pH在微生物培養(yǎng)的不同階段有不同的影響

當前64頁，總共123頁。pH的控制方式基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)通過補料調(diào)節(jié)pH，補料與調(diào)pH矛盾時，加酸堿調(diào)pH

發(fā)酵的不同階段采取不同的pH值選擇合適的pH調(diào)節(jié)劑當前65頁，總共123頁。

溶氧(DO)是需氧微生物生長所必需。在發(fā)酵過程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成為控制因素。

在28℃氧在發(fā)酵液中的100％的空氣飽和濃度只有0.25mmol.L-1左右，比糖的溶解度小7000倍。在對數(shù)生長期即使發(fā)酵液中的溶氧能達到100％空氣飽和度，若此時中止供氧，發(fā)酵液中溶氧可在幾分鐘之內(nèi)便耗竭，使溶氧成為限制因素。4.2.3氧的供需及對發(fā)酵的影響當前66頁，總共123頁。4.2.3.1微生物對氧的需求一、描述微生物需氧的物理量比耗氧速度或呼吸強度（QO2）：單位時間內(nèi)單位體積重量的細胞所消耗的氧氣，mmolO2·g菌-1·h-1

攝氧率(r)：單位時間內(nèi)單位體積的發(fā)酵液所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1

。r=QO2.X當前67頁，總共123頁。二、溶解氧濃度對菌體生長和產(chǎn)物形成的影響CCrQO2CLCCr:

臨界溶氧濃度,指不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度。當前68頁，總共123頁。一般對于微生物：CCr:

＝1～15%飽和濃度例：酵母4.6*10-3mmol.L-1,1.8%

產(chǎn)黃青霉2.2*10-2mmol.L-1,8.8%定義：氧飽和度＝發(fā)酵液中氧的濃度/臨界溶氧濃度所以對于微生物生長，只要控制發(fā)酵過程中氧飽和度>1.當前69頁，總共123頁。問題：一般微生物的臨界溶氧濃度很小，發(fā)酵過程中氧是

否很容易滿足呢？例：以微生物的攝氧率0.052mmolO2·L-1·S-1

計，而28℃氧在發(fā)酵液中的100％的空氣飽和濃度只有0.25mmol.L-1左右，故該氧氣濃度能滿足微生物生存時間為：

0.25/0.052=4.8秒注意：由于產(chǎn)物的形成和菌體最適的生長條件，常常不一樣：

頭孢菌素卷須霉素生長5%13%產(chǎn)物>13%>8%當前70頁，總共123頁。三、影響溶氧的因素r=QO2.X

菌體濃度QO2

遺傳因素

菌齡

營養(yǎng)的成分與濃度

有害物質(zhì)的積累

培養(yǎng)條件當前71頁，總共123頁。4.2.3.2發(fā)酵罐中氧的傳遞一、發(fā)酵液中氧的傳遞方程CCiPPi氣膜液膜N：傳氧速率kmol/m2.hkg:氣膜傳質(zhì)系數(shù)kmol/m2.h.atmKl:液膜傳質(zhì)系數(shù)m/h當前72頁，總共123頁。C*＝P/H,與氣相中氧分壓相平衡的液體中氧的濃度Kl:以氧濃度為推動力的總傳遞系數(shù)(m/h)再令：單位體積的液體中所具有的氧的傳遞面積為a(m2/m3)Nv：體積傳氧速率kmol/m3.hKla:以(C*-C)為推動力的體積溶氧系數(shù)h-1當前73頁，總共123頁。二、發(fā)酵液中氧的平衡發(fā)酵液中供氧和需氧始終處于一個動態(tài)的平衡中傳遞：消耗：r=QO2.X氧的平衡最終反映在發(fā)酵液中氧的濃度上面當前74頁，總共123頁。三、供氧的調(diào)節(jié)C有一定的工藝要求，所以可以通過Kla和C*來調(diào)節(jié)其中C*＝P/HNvHPKla當前75頁，總共123頁。調(diào)節(jié)Kla是最常用的方法，kla反映了設備的供氧能力，一般來講大罐比小罐要好。

45升1噸10噸攪拌速度250rpm120120供氧速率7.610.720.1當前76頁，總共123頁。4.2.3.3影響Kla的因素

Kla反映了設備的供氧能力，發(fā)酵常用的設備為搖瓶與發(fā)酵罐。一、影響搖瓶kla的因素為裝液量和搖瓶機的種類搖瓶機往復，頻率80-120分/次，振幅8cm旋轉(zhuǎn)，偏心距25、12,轉(zhuǎn)速250rpm當前77頁，總共123頁。裝液量，一般取1/10左右：

250ml15-25ml500ml30ml750ml80ml例：

500ml搖瓶中生產(chǎn)蛋白酶，考察裝液量對酶活的影響裝液量30ml60ml90ml120ml

酶活力71373425392當前78頁，總共123頁。二、發(fā)酵罐中

Kla影響因素當前79頁，總共123頁。已知在通風發(fā)酵罐中，全擋板條件下：當前80頁，總共123頁。1、理論上分析KLand通氣量提高攪拌速度，提高kla的效果顯著當前81頁，總共123頁。例:某一產(chǎn)品的發(fā)酵

dnp0/vc產(chǎn)量

4501801.6220%49784502802.1240%55645501802.6160%8455例:黑曲霉生產(chǎn)糖化酶

n230230270

通氣比1:0.81:1.21:0.8

產(chǎn)量181224162846提高d、n顯著提高C,提高了產(chǎn)量提高N,比提高Q有效當前82頁，總共123頁。2、實際上：對于轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)有時是有限度的

通風的增加也是有限的

蒸發(fā)量大

中間揮發(fā)性代謝產(chǎn)物帶走當前83頁，總共123頁。例：紅曲霉生產(chǎn)色素用于食品工業(yè)，靜止培養(yǎng)改為通氣培養(yǎng)，比色法測定產(chǎn)量：通氣靜止1.42.03.16.819.5OD0.280.78.315.614.36.2提高下降所以這些因素的存在，發(fā)酵設備的供養(yǎng)是有限的當前84頁，總共123頁。3、小型發(fā)酵罐和大型發(fā)酵罐調(diào)節(jié)kla的特點

小型發(fā)酵罐，轉(zhuǎn)速可調(diào)

大型發(fā)酵罐，轉(zhuǎn)速往往不可調(diào)

大型反應器的合理設計

對現(xiàn)有設備一定要注意工藝配套當前85頁，總共123頁。4、影響Kla的其它因素

空氣分布器：不同的形式影響Kla

液體的粘度：高粘度發(fā)酵的難度當前86頁，總共123頁。1、亞硫酸鹽法（冷模）氧→亞硫酸鈉的氧化Kla.C*=亞硫酸濃度的降低Cu2+

2Na2SO3+O2→2Na2SO44.2.3.4Kla的測定當前87頁，總共123頁。2、平衡法

rKla=————C*-CL例：一個裝料為7L的實驗室小罐，通氣量為1VVM（標態(tài)），發(fā)酵液的CL＝25%、空氣進入時的氧含量為21%，廢氣排出的氧含量為19.8%，求此時菌體的攝氧率和發(fā)酵罐的Kla。當前88頁，總共123頁。3、動態(tài)法

不同的測定方法得出的kla是不一樣的當前89頁，總共123頁。4.2.3.5溶氧濃度的變化及其控制一、典型的分批發(fā)酵中氧濃度的變化規(guī)律（一定Kla下）：rXQCL一般有一個低谷，在對數(shù)生長的末期當前90頁，總共123頁。發(fā)酵過程的控制一般策略：前期有利于菌體生長，中后期有利用產(chǎn)物的合成溶氧控制的一般策略：前期大于臨溶氧濃度，中后期滿足產(chǎn)物的形成。二、發(fā)酵過程中溶氧的控制1、溶氧控制的策略當前91頁，總共123頁。2、溶氧控制的實例GAXDO谷氨酸發(fā)酵：要求：氧飽和度>1控制：0-12小時小通風

12小時后增加通風原因：0-12小時菌體量較小，采用小通風12當前92頁，總共123頁。

一般認為，發(fā)酵初期較大的通風和攪拌而產(chǎn)生過大的剪切力，對菌體的生長有時會產(chǎn)生不利的影響，所以有時發(fā)酵初期采用小通風，停攪拌，不但有利于降低能耗，而且在工藝上也是必須的。但是通氣增大的時間一定要把握好。例：生產(chǎn)肌苷酸：通氣量不變17.15mg/ml24小時增加22.55mg/ml30小時增加18.25mg/ml36小時增加12.34mg/ml當前93頁，總共123頁。4.2.4發(fā)酵過程泡沫的形成與控制一、泡沫形成的基本理論泡沫的定義：一般來說：泡沫是氣體在液體中的粗分散體，屬于氣液非均相體系美國道康寧公司對泡沫這樣定義：體積密度接近氣體，而不接近液體的“氣/液”分散體。當前94頁，總共123頁。（一）泡沫形成的原因1、氣液接觸

因為泡沫是氣體在液體中的粗分散體，產(chǎn)生泡沫的首要條件是氣體和液體發(fā)生接觸。而且只有氣體與液體連續(xù)、充分地接觸才會產(chǎn)生過量的泡沫。氣液接觸大致有以下兩類情況：（1）氣體從外部進入液體，如攪拌液體時混入氣體（2）氣體從液體內(nèi)部產(chǎn)生。氣體從液體內(nèi)部產(chǎn)生時，形成的泡沫一般氣泡較小、較穩(wěn)定。當前95頁，總共123頁。2、含助泡劑

在未加助泡劑，但并不純凈的水中產(chǎn)生的泡沫，其壽命在0.5秒之內(nèi)，只能瞬間存在。搖蕩純?nèi)軇┎黄鹋?，如蒸餾水，只有搖蕩某種溶液才會起泡。在純凈的氣體、純凈的液體之外，必須存在第三種物質(zhì)，才能產(chǎn)生氣泡。對純凈液體來說，這第三種物質(zhì)是助泡劑。當形成氣泡時，液體中出現(xiàn)氣液界面，這些助泡劑就會形成定向吸附層。與液體親和性弱的一端朝著氣泡內(nèi)部，與液體親和性強的一端伸向液相，這樣的定向吸附層起到穩(wěn)定泡沫的作用。當前96頁，總共123頁。3、發(fā)酵過程泡沫產(chǎn)生的原因（1）通氣攪拌的強烈程度通氣大、攪拌強烈可使泡沫增多，因此在發(fā)酵前期由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分消耗少，培養(yǎng)基成分豐富，易起泡。應先開小通氣量，再逐步加大。攪拌轉(zhuǎn)速也如此。也可在基礎(chǔ)料中加入消泡劑。當前97頁，總共123頁。（2）培養(yǎng)基配比與原料組成因素培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，黏度大，產(chǎn)生泡沫多而持久，攪拌速度就不能太快。例：在50L罐中投料10L，成分為淀粉水解糖、豆餅水解液、玉米漿等，攪拌900rpm，通氣，泡沫生成量為稀培養(yǎng)基的2倍。

當前98頁，總共123頁。（3）菌種、種子質(zhì)量和接種量菌種質(zhì)量好，生長速度快，可溶性氮源較快被利用，泡沫產(chǎn)生幾率也就少。菌種生長慢的可以加大接種量

（4）滅菌質(zhì)量培養(yǎng)基滅菌質(zhì)量不好，糖氮被破壞，抑制微生物生長，使種子菌絲自溶，產(chǎn)生大量泡沫，加消泡劑也無效。當前99頁，總共123頁。（二）起泡的危害1、降低生產(chǎn)能力在發(fā)酵罐中，為了容納泡沫，防止溢出而降低裝量2、引起原料浪費如果設備容積不能留有容納泡沫的余地，氣泡會引起原料流失，造成浪費。

當前100頁，總共123頁。3、影響菌的呼吸

如果氣泡穩(wěn)定，不破碎，那么隨著微生物的呼吸，氣泡中充滿二氧化碳，而且又不能與空氣中氧進行交換，這樣就影響了菌的呼吸。4、引起染菌由于泡沫增多而引起逃液，于是在排氣管中粘上培養(yǎng)基，就會長菌。隨著時間延長，雜菌會長入發(fā)酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐頂進一步滲到軸封，軸封處的潤滑油可起點消泡作用，從軸封處落下的泡沫往往引起雜菌污染。當前101頁，總共123頁。1、常用消泡劑的種類和性能（1）天然油脂

天然油脂是最早用的消泡劑，如豆油、菜油、魚油等。油脂主要成分是高級脂肪酸酯和高級一元醇酯，還有高級醇、高級烴等。但油脂如保藏不好，易變質(zhì)，使酸值增高，對發(fā)酵有毒性。此外，有些油是發(fā)酵產(chǎn)物的前體，如豆油是紅霉素的前體，魚油是螺旋霉素的前體。近年來出于對環(huán)境保護的重視，天然產(chǎn)物消泡劑的地位又有些提高，而且還在研究新的天然消泡劑；二、泡沫的控制（一）、消泡劑消泡當前102頁，總共123頁。（2）聚醚類消泡劑

聚醚類消泡劑種類很多我國常用的主要是甘油三羥基聚醚。它是以甘油為起始劑，由環(huán)氧丙烷，或環(huán)氧乙烷與環(huán)氧丙烷的混合物進行加成聚合而制成的。在甘油分子上加成聚合環(huán)氧丙烷的產(chǎn)物叫聚氧丙烯甘油定名為GP型消泡劑；用于鏈霉素發(fā)酵，代替天然油，加入基礎(chǔ)料，效果很好。在GP型消泡劑的聚丙二醇鏈節(jié)末端再加成環(huán)氧乙烷，成為鏈端是親水基的聚氧乙烯氧丙烯甘油，也叫GPE型消泡劑（泡敵）。按照環(huán)氧乙烷加成量為10%，20%，……50%分別稱為GPE10，GPE20，……GPE50。這類消泡劑稱為“泡敵”。用于四環(huán)素發(fā)酵效果很好，相當于豆油的10~20倍。當前103頁，總共123頁。GP型的消泡劑親水性差，在發(fā)泡介質(zhì)中的溶解度小，所以宜使用在稀薄的發(fā)酵液中。它的抑泡能力比消泡能力優(yōu)越，適宜在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入，以抑制整個發(fā)酵過程的泡沫產(chǎn)生。

GPE型消泡劑親水性較好，在發(fā)泡介質(zhì)中易鋪展，消泡能力強，但溶解度也較大，消泡活性維持時間短，因此用在粘稠發(fā)酵液中效果較好。

GPES型消泡劑：在GPE型消泡劑鏈端用疏水基硬脂酸酯封頭，便形成兩端是疏水鏈，當中間隔有親水鏈的嵌段共聚物。這種結(jié)構(gòu)的分子易于平臥狀聚集在氣液界面，因而表面活性強，消泡效率高。當前104頁，總共123頁。（3）高碳醇高碳醇是強疏水弱親水的線型分子，在水體系里是有效的消泡劑。七十年代初前蘇聯(lián)學者在陰離子、陽離子、非離子型表面活性劑的水溶液中試驗，提出醇的消泡作用，與其在起泡液中的溶解度及擴散程度有關(guān)。

C7~C9的醇是最有效的消泡劑。

C12~C22的高碳醇借助適當?shù)娜榛瘎┡渲瞥闪６葹?~9μm，含量為20~50%的水乳液，即是水體系的消泡劑。苯乙醇油酸酯、苯乙酸月桂醇酯等在青霉素發(fā)酵中具有消泡作用，后者還可作為前體。當前105頁，總共123頁。（4）硅酮類

最常用的是聚二甲基硅氧烷，也稱二甲基硅油。它表面能低，表面張力也較低，在水及一般油中的溶解度低且活性高。

也有在硅油和SiO2氣溶膠的復合物中添加一種或兩種乳化劑，加熱溶勻，與增稠劑水溶液混合后乳化。增稠劑有羧甲基纖維素鈉鹽。這類消泡劑廣泛用于抗生素發(fā)酵及食品工業(yè)。值得注意的是：消泡劑有選擇性。消泡劑用多了有毒性，而且還影響通氣和氣體分散，因此要少量地加。當前106頁，總共123頁。一、染菌的影響

發(fā)酵過程污染雜菌，會嚴重的影響生產(chǎn)，是發(fā)酵工業(yè)的致命傷。造成大量原材料的浪費，在經(jīng)濟上造成巨大損失擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計劃。遇到連續(xù)染菌，特別在找不到染菌原因往往會影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性。影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量4.2.5染菌的防治當前107頁，總共123頁。（一）染菌對發(fā)酵的影響生產(chǎn)不同的品種，可污染不同種類和性質(zhì)的微生物。不同污染時間，不同污染途徑，污染不同菌量，不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件又可產(chǎn)生不同后果當前108頁，總共123頁。

疫苗生產(chǎn)危害很大?，F(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應全部廢棄。因此，發(fā)酵罐容積越大，污染雜菌后的損失也越大。熱源問題不同產(chǎn)品當前109頁，總共123頁。2、污染不同種類和性質(zhì)微生物的影響（1）污染噬菌體（2）污染其他雜菌：如耐熱芽孢桿菌當前110頁，總共123頁。3、不同時間染菌對發(fā)酵的影響

污染時間是指用無菌檢測方法確準的污染時間，不是雜菌竄入培養(yǎng)液的時間。雜菌進入培養(yǎng)液后，需有足夠的生長、繁殖的時間才能顯現(xiàn)出來，顯現(xiàn)的時間又與污染菌量有關(guān)。污染的菌量多，顯現(xiàn)染菌所需的時間就短，污染菌量少，顯現(xiàn)染菌的時間就長。當前111頁，總共123頁。（1）種子培養(yǎng)期染菌

由于接種量較小，生產(chǎn)菌生長一開始不占優(yōu)勢，而且培養(yǎng)液中幾乎沒有抗生素（產(chǎn)物）或只有很少抗生素（產(chǎn)物）。因而它防御雜菌能力低，容易污染雜菌。如在此階段染菌，應將培養(yǎng)液全部廢棄。當前112頁，總共123頁。（2）發(fā)酵前期染菌發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。原因：發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競爭優(yōu)勢；且還未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。在這個時期要特別警惕以制止染菌的發(fā)生。染菌措施：可以用降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整補料量，用酸堿調(diào)pH值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補加一些營養(yǎng)，重新接種再用。當前113頁，總共123頁。（3）發(fā)酵中期染菌

發(fā)酵中期染菌會嚴重干擾產(chǎn)生菌的代謝。雜菌大量產(chǎn)酸，培養(yǎng)液pH下降；糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產(chǎn)物分泌減少或停止，有時甚至會使已產(chǎn)生的產(chǎn)物分解。有時也會使發(fā)酵液發(fā)臭，產(chǎn)生大量泡沫。措施：降溫培養(yǎng)，減少補料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達一定水平可以提前放罐，或者抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。當前114頁，總共123頁。（4）發(fā)酵后期染菌

發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對雜菌有一定的抑制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對生產(chǎn)影響不大。如果染菌嚴重，又破壞性較大，可以提前放罐。當前115頁，總共123頁。（二）發(fā)酵染菌對提煉和產(chǎn)品質(zhì)量的影響1、發(fā)酵染菌對過濾的影響染菌的發(fā)酵液一般發(fā)粘，菌體大多數(shù)自溶，所以在發(fā)酵液過濾時不能或很難形成濾餅，導致過濾困難。即使采取加熱、冷卻、添加助濾劑等措施，使部分蛋白質(zhì)凝聚，但效果并不理想。2、發(fā)酵染菌對提煉的影響當前116頁，總共123頁。二、染菌原因

造成染菌的因素很多，但總結(jié)幾十年的經(jīng)驗，對絕大部分罐批染菌的原因是比較清楚的，但在實際生產(chǎn)中發(fā)酵染菌率仍比較高，可以說產(chǎn)生這種現(xiàn)象大多數(shù)是由于工作中“明知故犯”“不負責任”和“僥幸心理”所造成的。例如，滅菌的蒸汽壓不足不能滅菌；設備有滲漏不能進罐等等都