人胰島素的制備

人胰島素的制備計(jì)離戲悻甘子連減外源匸受體細(xì)胞ONA 1-外聯(lián)基因1=I轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增基園工程基富31毘示慝圖一、 獲得目的基因從供體細(xì)胞中提取mRNA，以其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成胰島素mRNA互補(bǔ)DNA，再以cDNA第一鏈為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶I的作用在，最終合成編碼它的雙鏈DNA序列。即得到了目的基因。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法（一）從人體細(xì)胞內(nèi)提取胰島素基因轉(zhuǎn)錄的mRNA細(xì)胞總RNA的提取：取胰島B細(xì)胞，用PBS洗后，加入TRIZOL試將細(xì)胞破裂，后用DEPC處理，多次離心后，取RNA白色沉淀，測(cè)0D值，電泳。2，從總RNA中分離mRNA：取上述提取的總RNA若干，加入BufferOBB，OligotexSuspension，打勻。70°C水浴（裂解RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)），20-30°C條件下，靜置（讓Oligotex與mRNA結(jié)合）。將Oligotex/mRNA復(fù)合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速離心，加Buffer將其他RNA洗脫，最后用瓊脂糖凝膠電泳純化mRNA。（二） mRNA轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈cone第一鏈的合成加入上步獲得的mRNA和適當(dāng)引物于EP管中，加入RNase-freewater，混勻后,70°C反應(yīng)10分鐘，反應(yīng)完成后，立刻將反應(yīng)體系置于冰上5min;稍微離心—下，順序加入緩沖液、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP（加入放射性同位素利于檢驗(yàn)）， 混勻，稍微離心反應(yīng)物之后,42°C放置2分鐘。取出置于冰上。電泳分析，同位素活性測(cè)定。（三） PCR法擴(kuò)增，特異合成目的cDNA鏈通過(guò)胰島素的特異引物，用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，特異的合成胰島素的cDNA鏈。PCR法的操作步驟：預(yù)變性引物退火引物延伸循環(huán)25-35次最后延伸前端引物：5'-ggttccggatctggttctggttctctggtcccccgcggtagtcaccaccaccaccaccaccgttttgtgaaccaacacctgtgcggc-3'后端引物：5'-agtgtcgacttagttgcagtagttctccagctggta-3'二、組建重組質(zhì)粒采用pQE—30質(zhì)粒作為載體，用雙酶切法進(jìn)行基因重組。1.雙酶切法用兩種酶限制性內(nèi)切核酸酸消化載體DNA和外源DNA片段，使載體和外源目的基因的兩端分別形成不同黏性末端，將它們混合，在連接酶的作用下相同的黏性末端可退火連接成重組DNA分子，從而實(shí)現(xiàn)DNA的定向連接。重組過(guò)程pQE—30用HindIII和BamHI酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離、回收純化酶切片段。外源DNA片段同樣也用HindIII和BamHI酶切并回收純化酶切片段。雙酶切后的載體外源DNA片段混合退火，因?yàn)镠indIII和BamHI的黏性末端不匹配，避免了載體和外源DNA片段的自身連接，外源DNA片段只能定向地連接到載體的HindIII和BamHI位點(diǎn)之間。當(dāng)然也不可避免發(fā)生載體的HindIII和BamHI的黏性末端之間的兩個(gè)堿基互補(bǔ)形成開(kāi)環(huán)，轉(zhuǎn)到大腸桿菌中被修復(fù)，但這樣的重組子占少數(shù)，是低效轉(zhuǎn)化。三、構(gòu)建基因工程菌（一）重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈同時(shí)表達(dá)法將人胰島素的A鏈和B鏈編碼序列拼接在一起，然后組裝在大腸桿菌-半乳糖苷酶基因的下游。重組子表達(dá)出的融合蛋白經(jīng)CNBr處理后，分離純化A-B鏈多肽，然后再根據(jù)兩條鏈連接處的氨基酸殘基性質(zhì)，采用相應(yīng)的裂解方法獲得A鏈和B鏈肽段，最終通過(guò)體外化學(xué)折疊制備具有活性的重組人胰島素。重組DNA的轉(zhuǎn)化CaCI2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞：取100ml菌體培養(yǎng)至0D600二，離心收集菌體，用10ml冰冷的10mMCaCI2溶液懸浮菌體，離心，收集菌體，用1ml冰冷的75mMCaCI2溶液懸浮菌體，冰浴放置12-24小時(shí)，備用。2，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取100ml感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50ng載體的重組，DNA連接液，混勻。冰浴放置半小時(shí)。在42°C保溫2分鐘（熱脈沖），快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1-2分鐘。加入1ml新鮮培養(yǎng)基，于37C培養(yǎng)1小時(shí)（擴(kuò)增）。涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。經(jīng)典的CaCl2轉(zhuǎn)化方法：a將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10分鐘,然后于4°C下3000g離心10分鐘。b棄去上清，用預(yù)冷的L的CaCl2溶液10ml輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置15-30分鐘后,4°C下3000g離心10分鐘。c棄去上清，加入4ml預(yù)冷含15%甘油的L的CaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。d感受態(tài)細(xì)胞分裝成200,的小份，貯存于-70C。e從-70C冰箱中取200,感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。f加入pBS質(zhì)粒DNA溶液（含量不超過(guò)50ng，體積不超過(guò)10^1），輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后。g42C水浴中熱擊90秒或37C水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。h向管中加入1mlLB液體培養(yǎng)基（不含Amp），混勻后37C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr）。i將上述菌液搖勻后取100^丨涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37°C培養(yǎng)16-24小時(shí)。（二）重組子的篩選和鑒定（載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)）初篩選隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化單菌落，在LB/AK培養(yǎng)基(含100pg/ml氨芐青霉素和50ug/ml卡那霉素)中進(jìn)行培養(yǎng)，用/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)情況用16.5%SDS.PAGE進(jìn)行分析。重組菌的后續(xù)鑒定直接電泳檢測(cè)法將初篩選獲得的重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取其質(zhì)粒DNA，通過(guò)PCR對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大，用電泳法檢測(cè)質(zhì)粒是否為重組質(zhì)粒。目的蛋白表達(dá)檢驗(yàn)所得菌體經(jīng)溶菌酶/超聲破碎細(xì)胞后得到的包涵體進(jìn)行SDS—PAGE分析，所需基因工程菌表達(dá)的外源蛋(His)6?Arg-Arg-人胰島素原以包涵體形式存在，其分子大小約為13kb，經(jīng)電泳與胰島素原marker對(duì)比，如條帶顯示有所需目的蛋白，則所得菌既可做工程菌使用，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，斜面保存以便后續(xù)使用。工程菌的保藏15%甘油保存菌種，菌液=20:80,,充分混勻后,-70度保藏。四、培養(yǎng)工程菌優(yōu)化發(fā)酵條件采用比濁法測(cè)定不同時(shí)間培養(yǎng)基中菌量，繪制基因工程菌的生長(zhǎng)曲線，在搖瓶培養(yǎng)的水平下，采用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵基因工菌，培養(yǎng)4小時(shí)候即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期可延長(zhǎng)至17小時(shí)。1，正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：采用正交法，選取搖瓶培養(yǎng)條件中七個(gè)主要因素進(jìn)行兩水平正交優(yōu)化，該七個(gè)因素為：種子活化方式，搖床轉(zhuǎn)速（通風(fēng)量），IPTG誘導(dǎo)溫度，接種量，IPTG添加量，誘導(dǎo)時(shí)間，補(bǔ)料方式。分別用A、B、C、D、E、F、G表示■以每升培養(yǎng)基收獲濕菌體的量及發(fā)酵液的A600為目標(biāo)量，考察條件優(yōu)化的效果，進(jìn)行八次實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，優(yōu)化出最佳實(shí)驗(yàn)條件。2，其他條件優(yōu)化：在優(yōu)化發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步就各種金屬元素對(duì)苗體生長(zhǎng)發(fā)重組蛋白誘導(dǎo)的影響作了分析。3，放大培養(yǎng)（比較不同發(fā)酵工藝產(chǎn)量）：在優(yōu)化搖瓶水平發(fā)酵試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，放大至1L培養(yǎng)基中比較兩種發(fā)酵工藝。在不同轉(zhuǎn)速，通氣量，pH條件下，比較選擇產(chǎn)量最高的發(fā)酵工藝。五、產(chǎn)物分離純化由于基因工程藥物是從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、而不是從正常細(xì)胞生產(chǎn)的，所以對(duì)產(chǎn)品的純度要求也要高于傳統(tǒng)產(chǎn)品?；蚬こ趟幬锏姆蛛x純化一般不應(yīng)超過(guò)4-5個(gè)步驟，包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。發(fā)酵液進(jìn)行細(xì)胞分離，分別得到胞內(nèi)產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物。胞外產(chǎn)物直接進(jìn)行透析濃縮然后進(jìn)行再?gòu)?fù)性及酶轉(zhuǎn)化，再對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行高度純化，最后制劑即可。胞內(nèi)產(chǎn)物用溶酶菌或超聲波將細(xì)胞破碎，細(xì)胞破碎后用高速離心法進(jìn)行固液分離。分離后用變性劑或者離子去污劑得到包含體，再用變性劑（尿素）使其變形，接著用二次復(fù)性法將其復(fù)性。對(duì)復(fù)性后的產(chǎn)物進(jìn)行透析濃縮，然后進(jìn)行再?gòu)?fù)性及酶轉(zhuǎn)化，再對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行高度純化，最后制劑即可。重組蛋白分離純化的特點(diǎn)重組蛋白質(zhì)分離純化的特點(diǎn)為：(1)大多數(shù)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品是生物活性物質(zhì)，在分離純化過(guò)程中，有機(jī)溶劑、溶液pH值、離子強(qiáng)度的變化均可使蛋白質(zhì)變性失活a(2)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品在物料中含量很低，凰物料組成非常復(fù)雜。例如，利用基因工襁菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白藤，物料中含有大量綴成復(fù)雜的培養(yǎng)基、榮體生產(chǎn)代謝物等，疆揀蛋鑫囊魏含量囂豢不瑟蛋鑫凄慈爨鵑1％。舂些囂揀鬣囊矮存在予綴懿武或在胞內(nèi)形成包含體，為獲敬蛋白質(zhì)，還需避行細(xì)脆破碎，結(jié)鬈物料中含有大量的細(xì)胞碎片和胞內(nèi)產(chǎn)物。(3)含蛋白質(zhì)產(chǎn)晶的物料不穩(wěn)定，蛋白質(zhì)產(chǎn)品易受料液中蛋自水解酶降解。(4)很多熏組蛋白質(zhì)產(chǎn)品作為醫(yī)藥、食品被人炎利用，因而要求蛋國(guó)艨產(chǎn)器必綏是裹癀縫銫瓣，產(chǎn)蘸無(wú)螢、茲致熱源等。與傳統(tǒng)麓生物大分子分離方式楣鐨，蘩綴蛋臼的分離純純恣憝秘用其攜理稻化學(xué)性質(zhì)的差異，即以分子的大小、形狀、溶解度、等電點(diǎn)、祭疏水性以及與其它分子的親和性等性質(zhì)建立起來(lái)的。二次復(fù)性法：0.5g包涵體溶解于一定量的緩沖液B(50mmol/LGIy—Na0H,8mol/L尿素,B_巰基乙醇，pH9.5)中，使之充分混懸，靜置1小時(shí)以上?；鞈乙悍植街鸬渭尤氲骄彌_液C(50mmol/LGly-NaOH，半胱氨酸一胱氨酸，pH9.5)中，4°C靜置復(fù)性過(guò)夜。上樣于已用50mmol/LGly—NaOH(pH9.5)平衡的DEAE-SepharoseFF柱，用0.1mol/L的氯化鈉梯度洗脫，通過(guò)SDS確定RRhPI位置，用DEAE-SepharoseFF做離子交換層析，收集含RRhPI的洗脫峰2,層析圖譜見(jiàn)(圖6)。電泳檢測(cè)顯示(圖11)峰2主要為RRhPI，及少量高分子雜質(zhì)，收集峰2做再?gòu)?fù)性。峰1為pH高于9.5及一些疏水性蛋白質(zhì)形成的穿透峰，絕大部分pH低于RRhPI的蛋白質(zhì)和核酸類雜質(zhì)則牢固地結(jié)合在柱子上，在較高鹽濃度及2mol/LNaCI的條件下被洗脫下來(lái)，形成其他峰3和峰4。胰島素原(RRhPI)的再?gòu)?fù)性及酶切轉(zhuǎn)化：復(fù)性將初步復(fù)性及純化后的RRhPI通過(guò)透析濃縮，先后轉(zhuǎn)換到緩沖液B和D(50mmol/LG1y-NaOH，氧化型谷胱甘肽(GSSG)-還原型谷胱甘(GSH)pH9.5)中，使蛋白濃度為0.1?O.6mg/ml,4°C靜置過(guò)夜。酶切復(fù)性后的RRhPI復(fù)性液調(diào)節(jié)pH后加入一定量的胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptidaseB)在37。C進(jìn)行協(xié)同酶切一段時(shí)間，然后滴加2mol/LZnCI:至ZnCl:濃度為O.lmol/L終止反應(yīng)并沉淀生成的hl,用雙蒸水洗滌沉淀得較純B9重組人胰島素約79mg/L培養(yǎng)基。重組胰島素粗品的純化：胰島素粗品用0.2mol/LNaAc?HAc，pH4.0溶解。溶解后的樣品通過(guò)Superdex75進(jìn)行純化(圖10)，得1、2、3峰，收集峰3，透析后凍干即

kll■MBItO20.1肛2JJHQh低分子量棕隹；九kll■MBItO20.1肛2JJHQh低分子量棕隹；九人熊島素標(biāo)準(zhǔn)品；3.人曠島素制品4.二狀復(fù)性狀中通過(guò)DEAE需qjharo能FF純化的RRhPI六、 除菌過(guò)濾傳統(tǒng)過(guò)濾只能濾去空氣中的塵埃、液體中的異物微粒，很難去除微生物活體（細(xì)菌、病毒及熱原體）；薄膜過(guò)濾是微孔篩分，大于孔徑的微粒均被截留，微生物粒子大小為微米，只要選用微米的微孔濾膜即可將微生物截留去除，用微米的微孔濾膜則可能將病毒、熱原體去除。。注射用藥液除用傳統(tǒng)過(guò)濾器去除藥液中的異物外，現(xiàn)已采用微孔濾膜將澄清的藥液再次除菌、除熱原，其濾膜孔徑最好在微米以下。制藥空氣的過(guò)濾亦因GMP的不同級(jí)別要求而采用相應(yīng)的器材、過(guò)濾器。要指出的是，制藥無(wú)菌空氣的供應(yīng)僅采用傳統(tǒng)濾材、濾器往往不能達(dá)到要求，其終端必須選用微孔薄膜，孔徑必須在0。45微米以下。注射用無(wú)菌藥液的處理：按GMP要求，注射用藥液應(yīng)當(dāng)無(wú)菌無(wú)熱原，本品藥液配制好后，經(jīng)過(guò)粗砂棒、細(xì)砂棒（適當(dāng)使用滑石粉或碳粉）過(guò)濾成澄明液后，再經(jīng)過(guò)微米多層微孔濾芯除菌，終端通過(guò)微米單層超微孔濾膜后上機(jī)灌裝。目前，用于過(guò)濾器常用的主要過(guò)濾材料大致有以下幾種：混合纖維素酯常用來(lái)制成圓形的單片平板濾膜，用于液體和氣體的精過(guò)濾；聚丙烯（PP）做成折疊式，常用于筒式過(guò)濾器，有較大的孔徑，其具有親水性，屬粗過(guò)濾材料；聚偏二氟乙烯（PVDF）屬精過(guò)濾材料，耐熱和耐化學(xué)穩(wěn)定，蒸汽滅菌承受性良好，可制成親水性濾膜，較廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè)無(wú)菌制劑用水及注射用水的過(guò)濾；做成折疊式，常用于筒式過(guò)濾器，耐溫耐水解性能好，親水性材料，用于精度較高的溶液的精過(guò)濾；尼龍做成折疊式，常用于筒式過(guò)濾器，親水性材料，常用作液體的精過(guò)濾；聚四氟乙烯（PTFE）做成折疊式，常用于筒式過(guò)濾器，疏水性材料，其是使用相當(dāng)廣泛的一種材料，耐熱耐化學(xué)穩(wěn)定，常用于水、無(wú)機(jī)溶劑及空氣的精過(guò)濾。除菌過(guò)濾器的特點(diǎn)（1） 除菌過(guò)濾器一般采用十字懸掛式，水平進(jìn)出。多芯過(guò)濾器可設(shè)計(jì)成落地式。（2） 有些使用場(chǎng)合根據(jù)實(shí)際需要分成預(yù)過(guò)濾器、精過(guò)濾器兩種。（3） 空氣流向：從外向內(nèi)穿過(guò)濾芯。（4） 進(jìn)入除菌過(guò)濾器的壓縮空氣必須先經(jīng)過(guò)至少三級(jí)的精密過(guò)濾器及干燥機(jī)。除油、除水、除塵，油霧濃度應(yīng)W,否則將影響除菌濾芯的壽命，達(dá)不到預(yù)期的除菌效果。（5）定期殺菌，根據(jù)實(shí)際使用情況每周或每月1~2次，每次30分鐘，采用經(jīng)過(guò)1U過(guò)濾精度的潔凈飽和蒸汽殺菌。蒸汽溫度V140°C，蒸汽壓力V。閥門(mén)緩慢開(kāi)關(guān)。（6）作為罐體、設(shè)備的呼吸器使用時(shí)，其作用主要在于連通大氣防止設(shè)備內(nèi)部負(fù)壓和隔離開(kāi)空氣中的污染源，過(guò)濾方面的功能不大，因此在過(guò)濾上基本無(wú)要求。對(duì)胰島素進(jìn)行除菌過(guò)濾后采用胰島素凍干粉等凍干技術(shù)凍干，既得胰島素結(jié)晶。經(jīng)包裝等工序后的成品。如下圖：七、 半成品檢定重組人胰島素半成品檢測(cè)（檢測(cè)提取純化后重組人胰島素樣品）：一）雜質(zhì)檢定有關(guān)物質(zhì)：取本品適量，用L鹽酸溶液制成每1ml中含的溶液，作為供試品溶液。取供試品溶液20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按面積歸一化法計(jì)算，含A21脫酰胺人胰島素不得過(guò)%，其他有關(guān)物質(zhì)總量不得過(guò)％。高分子蛋白質(zhì)：取本品適量，用L鹽酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液，作為供試品溶液。按照分子排阻色譜法試驗(yàn)。以色譜用親水改性硅膠為填充劑（5?10m）；冰醋酸-乙腈%精氨酸溶液（15：20：65）為流動(dòng)相，流速為每分鐘，檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm。取重組人胰島素單體-二聚體對(duì)照品，用L鹽酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液；取100l注入液相色譜儀，重組人胰島素單體與二聚體的分離度應(yīng)符合要求。取供試品溶液100I，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，除去保留時(shí)間大于人胰島素主峰的其它峰面積，保留時(shí)間小于人胰島素主峰的所有峰面積之和不得過(guò)％。鋅：對(duì)照品溶液的制備精密量取鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000^g/ml）5ml，置100ml量瓶中，加L鹽酸溶液至刻度，搖勻。供試品溶液的制備精密稱取本品適量，用L鹽酸溶液制成每1ml中含鋅約~^g的溶液，搖勻。測(cè)定法精密量取對(duì)照品溶液，用L鹽酸溶液分別稀釋成每1ml鋅含量為|ig、Ug、Ug、Ug、Ug的溶液。將上述各溶液與供試品溶液，照原子吸收分光光度法，在的波長(zhǎng)處測(cè)定，按干燥品計(jì)，含鋅量不得過(guò)％。熾灼殘?jiān)喝”酒芳s0.2g，依法檢查，遺留殘?jiān)坏眠^(guò)％。（二）效價(jià)測(cè)定：按照高效液相色譜法測(cè)定取本品適量，精密稱定，用L鹽酸溶液定量稀釋至每1ml中約含10單位的溶液（臨用新配）。精密量取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取重組人胰島素對(duì)照品適量，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以人胰島素峰面積（包括A21脫酰胺峰面積）計(jì)算，即得。（三）胰島素生物測(cè)定法本法系比較胰島素標(biāo)準(zhǔn)品（S）與供試品（T）引起小鼠血糖下降的作用，以測(cè)定供試品的效價(jià)。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取胰島素標(biāo)準(zhǔn)品適量，按標(biāo)示效價(jià)，加入每100ml中含有苯酚并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為的%氯化鈉溶液，使溶解成每1ml中含20單位的容易忘，4~8°C貯存，以不超過(guò)5天為宜。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的制備試驗(yàn)當(dāng)日，精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按高低劑量組（ds,2ds｝）加0.9氯化鈉溶液（pH2.5）制成兩種濃度的稀釋液，高低劑量的比值（r）1不得大于1:0.5。高濃度稀釋液一般可制成每1ml中含0.06^0.12單位，調(diào)節(jié)劑量使低劑量能引起血糖明顯下降，高劑量不致差別。供試品溶液與稀釋液的制備按供試品的標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)（A），照標(biāo)準(zhǔn)品T溶液與其稀釋液的制備法制成高、低兩種濃度的稀釋液，其比值（r）應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品相等，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品高低劑量所致的反應(yīng)平均值應(yīng)相近。測(cè)定法取健康合格、同一來(lái)源、同一性別、出生日期相近的成年小鼠，體重相差不得超過(guò)3g，按體重隨機(jī)等分成4組，每組不少于10只，逐只編號(hào)，各組小鼠分別自皮下注人一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或供試品稀釋液，每鼠0.2V.3ml，但各鼠的注射體積（ml）應(yīng)相等。注射后40分鐘，按給藥順序分別自眼靜脈叢采血，用適宜的方法，如葡萄糖氧化酶一過(guò)氧化酶法測(cè)定血糖值。第一次給藥后間隔至少3小時(shí)，按雙交叉設(shè)計(jì)，對(duì)每組的各鼠進(jìn)行第二次給藥，并測(cè)定給藥后40分鐘的血糖值。照生物檢定統(tǒng)計(jì)法（附錄XlV）中量反應(yīng)平行線測(cè)定雙交叉設(shè)計(jì)法計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差。本法的可信限率（FL%）不得大于25%（四）注射液檢測(cè)1，滲透壓摩爾濃度：除另有規(guī)定外，靜脈輸液及椎管注射用注射液按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，照滲透壓摩爾濃度測(cè)定法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。2，可見(jiàn)異物:除另有規(guī)定外，照可見(jiàn)異物檢查法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。3，不溶性微粒：除另有規(guī)定外，溶液型靜脈用注射液、注射用無(wú)菌粉末及注射用濃溶液照不溶性微粒檢查法檢查，均應(yīng)符合規(guī)定。3，無(wú)菌:按照無(wú)菌檢查法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。4，細(xì)菌內(nèi)毒素或熱原：除另有規(guī)定外，靜脈用注射劑按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，照細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法或熱原檢查法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。熱原（pyrogen）熱原的定義:注射后能引起人體特殊致熱反應(yīng)的物質(zhì)。熱原的組成:熱原是微生物的代謝產(chǎn)物，是微生物的一種內(nèi)毒素，大多數(shù)細(xì)菌都能產(chǎn)生熱原，革蘭氏陰性桿菌致熱力最強(qiáng)。熱原由磷脂、脂多糖和蛋白質(zhì)所組成的復(fù)合物，其中脂多糖是致熱活性中心。脂多糖組成因菌種的不同而異，熱原的分子量106左右。熱原的危害:含熱原的注射劑輸入人體后，約半小時(shí)人體就發(fā)冷、寒戰(zhàn)、體溫升高、全身痛、出汗、惡心嘔吐等，嚴(yán)重時(shí)高燒40度、昏迷、虛脫甚至死亡。八、成品檢定重組人胰島素成品檢測(cè)（即檢測(cè)重組人胰島素注射液樣品）：本品為重組人胰島素的無(wú)菌水溶液。其效價(jià)應(yīng)為標(biāo)示量的％?110.%。本品可加入適量的苯酚或間甲酚作抑菌劑。【鑒別】（1） 取本品，按照重組人胰島素項(xiàng)下的鑒別項(xiàng)試驗(yàn)，顯相同的結(jié)果。（2） 在苯酚或間甲酚檢查項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液中苯酚峰或間甲酚峰的保留時(shí)間應(yīng)與苯酚或間甲酚對(duì)照品的保留時(shí)間一致。檢查】有關(guān)物質(zhì)取本品，每1ml中加/L鹽酸溶液3|j丨酸化，混勻后作為供試品溶液；取供試品溶液適量（約相當(dāng)于人胰島素2單位），按照重組人胰島素項(xiàng)下的方法檢查，扣除苯酚峰和間甲酚峰，按面積歸一化法計(jì)算，A21脫酰胺人胰島素不得過(guò)%，其他有關(guān)物質(zhì)總量不得過(guò)%。高分子蛋白