2014年實驗六-食品中大腸菌群檢驗

1.食品微生物檢驗的意義有害微生物對人類和生產(chǎn)的影響：引起食品變質(zhì)引起食物中毒導致人體患病第一頁，共23頁。1.食品微生物檢驗的意義是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標,也是判定被檢食品能否食用的科學依據(jù)可以判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生的情況,為衛(wèi)生管理工作提供科學依據(jù)可以有效地防止或減少食物中毒和人畜共患病的發(fā)生保證產(chǎn)品的質(zhì)量,避免不必要的損失第二頁，共23頁。生產(chǎn)環(huán)境的檢驗原輔料的檢驗食品加工、儲藏、銷售儲環(huán)節(jié)的檢驗食品的檢驗2.食品微生物檢驗的范圍第三頁，共23頁。3.食品衛(wèi)生標準中的微生物指標指示菌概念:在常規(guī)安全衛(wèi)生監(jiān)測中，用以指示檢樣衛(wèi)生狀況及安全性的指示性微生物類型：一般性、特定性（如糞便污染）、其他項目：菌落總數(shù)、大腸菌群、耐熱大腸菌群、總大腸菌群第四頁，共23頁。一、實驗?zāi)康?.了解大腸菌群在食品檢驗中的意義。2.掌握檢驗的程序和步驟。3.通過MPN檢索表的檢索得出實驗結(jié)果。第五頁，共23頁。二、基本原理大腸菌群系指一群在32～37℃下24h內(nèi)，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標，來評價食品衛(wèi)生質(zhì)量狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能。具有廣泛的衛(wèi)生學意義。第六頁，共23頁。產(chǎn)氣克雷白氏菌ETEC

EIEC

陰溝腸桿菌EHEC

大腸菌群耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）大腸桿菌產(chǎn)氣克雷白氏菌大腸埃希氏菌檸檬酸桿菌O157：H7大腸桿菌是人和溫血動物腸道內(nèi)普遍存在的細菌，是糞便中的主要菌種。一般生活在人大腸中并不致病，但它侵入人體一些部位時，可引起感染。大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛(wèi)生細菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致。一般認為可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。

總大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24小時能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。耐熱大腸菌群即糞大腸菌群，作為一種衛(wèi)生指標菌，耐熱大腸菌群中很可能含有糞源微生物，因此耐熱大腸菌群的存在表明可能受到了糞便污染，可能存在大腸桿菌。但是，耐熱大腸菌群的存在并不代表對人有什么直接的危害。致病性大腸桿菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細胞，具有痢疾桿菌樣致病力。腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸毒素性大腸桿菌（ETEC）和腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）等。O157:H7（EHEC)腸出血性大腸桿菌，感染性腹瀉是近年來新發(fā)現(xiàn)的危害嚴重的腸道傳染病，已逐漸成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問題。大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌的從屬關(guān)系第七頁，共23頁。大腸菌群的食品衛(wèi)生學意義作為糞便污染食品的指標菌，MPN值愈低則說明食品受糞便污染程度及對人體健康危害程度愈低作為腸道致病菌污染食品的指針，大腸菌群數(shù)量越多則腸道致病菌存在的可能性就越高，但兩者之間并不總是呈平行關(guān)系要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量第八頁，共23頁。GB4789.3-2010《大腸菌群計數(shù)》第一法：大腸菌群MPN計數(shù)法第二法：大腸菌群平板計數(shù)法三、檢測方法第九頁，共23頁。

最近似數(shù)測定法（MPN）是指對未知樣品做連續(xù)的10倍稀釋，選擇3個連續(xù)的10倍稀釋液，每種稀釋液接種3管裝有培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，根據(jù)LST初發(fā)酵試驗以及BGLB發(fā)酵證實實驗，證實大腸菌群的陽性管數(shù)，查MPN檢索表，報告每g（mL）樣品中大腸菌群的最可能數(shù)。食品中大腸菌群數(shù)以每g（mL）樣品中大腸菌群的最可能數(shù)來表示，即為大腸菌群MPN值。第十頁，共23頁。需要用到的培養(yǎng)基（1）LST肉湯培養(yǎng)基：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨成分：胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCL5.0g，乳糖5.0g，K2HPO42.75g，KH2PO42.75g，月桂基硫酸鈉0.1g，蒸餾水1000mL。制法：將各成分溶解于蒸餾水中。分裝到有倒立發(fā)酵管的20mm×150mm試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。最終pH6.8±0.2。第十一頁，共23頁。（2）BGLB：煌綠乳糖膽鹽肉湯成分：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，牛膽粉溶液200mL，0.1%煌綠水溶液13.3mL，蒸餾水800mL，pH7.2±0.1。3個三角瓶（含玻珠）中，225ml/個9支試管，3支/組，9ml/支第十二頁，共23頁。抑菌劑的選擇大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。國家標準中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細菌的生長和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時也產(chǎn)生一些抑制作用。第十三頁，共23頁。實驗步驟及操作要點：1）無菌取樣并制作梯度稀釋液；梯度稀釋法依次稀釋樣品到10-42）樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。3）從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。第十四頁，共23頁。10-210-310-4第十五頁，共23頁。0將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯LST不產(chǎn)氣（-）小導管里無氣泡LST產(chǎn)氣（+）第十六頁，共23頁。4）初發(fā)酵試驗

選擇10-2、10-3、10-4三個稀釋度的樣品均液（液體樣品可以選擇原液），用無菌移液管分別吸取1mL到LST發(fā)酵液試管中，每管接種1mL，每個稀釋度做3個平行（共9管）,36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進行復發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進行復發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。第十七頁，共23頁。LST結(jié)果判斷大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管。第十八頁，共23頁。5）復發(fā)酵試驗用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。第十九頁，共23頁。6）大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告按5）確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。陽性管數(shù)0.100.010.001LST發(fā)酵管BGLB證實管第二