基因工程2012b的資料

基因工程2012b的資料第1頁/共139頁載體的要求:作為載體，應(yīng)該具有以下一些性能：A、復(fù)制：具有能在受體細胞中復(fù)制的復(fù)制起點，基因工程的目的是要得到基因的無性繁殖系，并且要求得到最大量的某一基因或基因產(chǎn)物，因此一般要求用屬于松弛型的質(zhì)粒作為載體。細菌質(zhì)粒ColE1是一種常用的載體；B、選擇性標(biāo)記：一般情況下，所要擴增的基因不便于選擇，所以作為載體要求具有選擇標(biāo)記。ColE1對于大腸肝菌素E1的免疫性卻不是一個理想的標(biāo)記。R質(zhì)粒具有最適宜于作為選擇性標(biāo)記的多種抗性基因，但不很安全；第2頁/共139頁C、限制性酶切位點：對于某一種限制性酶，它的切點數(shù)要求是單一的?，F(xiàn)在已發(fā)展了許多具有多種單一的限制性酶識別位點的載體；D、載體的大?。涸瓌t上要求載體越小越好；E、外源基因的性狀表達：結(jié)構(gòu)基因的表達需要啟動子；F、載體的安全性：要求質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移?！钍裁茨軌蜃鳛檩d體？怎么做？第3頁/共139頁AcircularpieceofautonomouslyreplicatingDNA1.1.1

Whatisaplasmid?

OriginallyevolvedbybacteriaMayexpressantibioticresistancegeneorbemodifiedtoexpressproteinsofinterestoribla1.1質(zhì)粒載體第4頁/共139頁ThemanyfacesofplasmidsGraphicTransmissionelectronmicrographAgaroseGelpGLOoriblaGFParaC第5頁/共139頁野生的質(zhì)粒往往不符合作為載體的要求，因此必須對它們進行改造：A、刪除不必要的DNA區(qū)域。盡量縮小質(zhì)粒的分子量，以提高外源DNA片段的裝載量。B、減少限制性酶切點。缺失突變，限制性酶、核酸外切酶核連接酶的共同作用，機械破碎和質(zhì)粒之間的重組等方法。1.1.2質(zhì)粒的改造第6頁/共139頁C、加入易于識別的選擇性標(biāo)記，便于檢測含有重組質(zhì)粒的受體細胞。通過質(zhì)粒之間的重組，可以使質(zhì)粒帶有合適的選擇性標(biāo)記。

D、關(guān)于質(zhì)粒安全性能的改造。滅活質(zhì)粒在細菌之間轉(zhuǎn)移的mob基因。兩個例子pBR322和pUC18/19第7頁/共139頁注：1、新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因類似卡那霉素(Kanr)。

2、AmprorApr,CmlrorCmr,TetrorTcr.常用的抗生素抗性標(biāo)記基因第8頁/共139頁第9頁/共139頁☆為什么要用2個抗性標(biāo)記？第10頁/共139頁抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法)第11頁/共139頁常用的生化遺傳標(biāo)記基因：1.β-半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）

β-半乳糖苷酶基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負責(zé)四聚體裝配，后者具β-半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補作用。這兩個部分可獨立存在，分別由兩個基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個基因（LacZ和LacZα）均可作為標(biāo)記基因。

β-半乳糖苷酶基因的優(yōu)點:a.

酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀；b.lacZα編碼5‘-端可容許很大的變化而不影響酶活性；c.lacZα和β鏈基因的分別表達可使載體小而容量大。2.葡萄糖苷酸酶基因（GUS）該基因編碼一種可分解各種β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標(biāo)記基因除具有上述lacZ基因的優(yōu)點外，它的適用范圍十分廣泛，因為許多生物中沒有這種基因。3.熒光素酶基因熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，若在反應(yīng)中加入CoA，可使靈敏度提高10倍；或由發(fā)光細菌（Photobacteriumfischeri）產(chǎn)生的熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯(lián)用，通過NAD(P)H的變化測定酶活。4.發(fā)光蛋白質(zhì)基因(GFP)發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落發(fā)綠色熒光。第12頁/共139頁pGLOoriblaGFParaCpGLOPlasmidBetaLactamaseAmpicillinresistance

GreenFluorescentProteinAequoreavictoriajellyfishgenearaCregulatorproteinRegulatesGFPtranscription第13頁/共139頁☆A(yù)multiplecloningsite(MCS),alsocalledapolylinker,isashortsegmentofDNAwhichcontainsmany(upto~20)restrictionsites-astandardfeatureofengineeredplasmids.RestrictionsiteswithinanMCSaretypicallyunique,occurringonlyoncewithinagivenplasmid.

為什么需要？☆lacZ’-β半乳糖苷酶α-肽鏈（氨基端）第14頁/共139頁lacZ-β-半乳糖苷酶-分解半乳糖iPO調(diào)控蛋白Pα-肽段分解X-gal產(chǎn)物呈現(xiàn)藍色誘導(dǎo)劑IPTGa-互補顯色反應(yīng)（藍白斑篩選）β-半乳糖苷酶基因lacZ突變體M15第15頁/共139頁X-galX-gal+-peptideC-terminusofb-galactosiase

第16頁/共139頁α-互補(α-complementation)第17頁/共139頁pGEM-TVector圖譜特點:1.克隆PCR產(chǎn)物2.通過多克隆區(qū)域兩側(cè)的T7和SP6RNA聚合酶啟動子進行體外轉(zhuǎn)錄3.產(chǎn)生ssDNA4.通過藍、白菌落篩選重組體5.多克隆區(qū)域提供選擇克隆的酶切位點

經(jīng)TaqDNA聚合酶擴增后的PCR產(chǎn)物末端都帶有單個A。正是基于這一原理，pGEM質(zhì)粒經(jīng)EcoRV切成平端后，在開口端加上一個T制成T載體，一方面避免了自身環(huán)化，另一方面由于T-A互補，從而提高了T載體與PCR產(chǎn)物之間的連接效率。由于T-A克隆只需純化PCR產(chǎn)物，因而操作較為簡便。pGEM-Tvector含絲狀噬菌體f1的復(fù)制起始區(qū)，用于產(chǎn)生環(huán)狀ssDNA；含有T7和SP6RNA聚合酶啟動子；在多克隆區(qū)域具有編碼β-半乳糖苷酶的基因(LacZ)，插入失活α-肽可在指示平板上通過藍、白菌落直接篩選重組菌落。

第18頁/共139頁1.1.3質(zhì)粒載體的分類及用途人工構(gòu)建的載體根據(jù)其功能和用途可分為下列6類：A、克隆載體。用于克隆和擴增外源基因，它們或者含有能為氯霉素擴增的松弛型復(fù)制子結(jié)構(gòu)，如pBR系列；或者復(fù)制子經(jīng)過人工誘變，解除對質(zhì)?？截悢?shù)的負調(diào)控作用，使質(zhì)粒在每個細胞中可達數(shù)千個復(fù)制拷貝。第19頁/共139頁質(zhì)粒pBR322為載體的克隆過程☆PCR擴增一個500bp的DNA片段并使用puc18/19作為載體進行克隆，描述棋原理過程和可能出現(xiàn)的問題及解決方法？第20頁/共139頁B、測序載體。這類載體通常高拷貝復(fù)制，并含有Polylinker,便于各種DNA片段的克隆與擴增。在Polylinker的兩端含有兩個不同的引物序列（T3/T5），使得重組質(zhì)粒經(jīng)堿變性后即可進行DNA測序反應(yīng)，如pUC18/pUC19系列。另一種測序質(zhì)粒是M13噬菌體DNA與質(zhì)粒DNA的雜合分子，如M13mp系列，它們在受體細胞中復(fù)制后，可以特定的單鏈DNA形式分泌到細胞外，克隆在這種質(zhì)粒上的外源基因無需變性即可直接用于測序反應(yīng)。第21頁/共139頁C、穿梭載體。這種質(zhì)粒分子上含有兩個親緣關(guān)系不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的選擇性標(biāo)記基因，因此能在兩種不同種屬的受體細胞種復(fù)制并檢測，如大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒、大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒等。☆為什么要發(fā)展穿梭載體？第22頁/共139頁D、探針載體。這類載體被用來篩選克隆基因的表達調(diào)控元件，如啟動子和終止子等。它通常裝有一個可以定量檢測其表達程度的報告基因（如抗生素的抗性基因），但缺少相應(yīng)的啟動子或終止子，因此載體分子本身不能表達報告基因，只有當(dāng)含有啟動子或終止子的外源DNA片段插入到載體合適的位點上，報告基因才能表達，而且其表達量的大小直接反映了被克隆的基因表達調(diào)控元件的強弱?！钊绾慰寺〗K止子？第23頁/共139頁E、表達載體。這類載體在Polylinker的上游和下游分別裝有轉(zhuǎn)錄效率較高的啟動子、合適的核糖體結(jié)合位點（SD-序列）以及強有力的終止子結(jié)構(gòu)，使得克隆的外源基因均能在受體細胞中高效表達，如pSPORT系列和pSP系列。第24頁/共139頁1.1.4質(zhì)粒的制備

目前一般使用堿變性法制備質(zhì)粒，苯酚/氯仿純化。分離得到的質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)多條帶。這是由于不同的DNA構(gòu)型所引起的。從大到小分別為OC-DNA,L-DNA,CCC(SC)-DNA.SCOCL第25頁/共139頁細菌培養(yǎng)過夜離心收集菌體加SolutionI加SolutionII加SolutionIII抽提純化沉淀干燥溶解在TE中SDS和NaOH,PH12.6NaAc,PH4.8葡萄糖和EDTA第26頁/共139頁圖2-2質(zhì)粒的電泳圖(A-E為不同質(zhì)粒電泳圖，Marker為λDNA的HindIII酶切圖)第27頁/共139頁1.2噬菌體載體1.2.1λ噬菌體載體類型什么是噬菌體?噬菌體是一類細菌病毒的總稱,Bacteriophage.見圖.以質(zhì)粒為基礎(chǔ)和噬菌體為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體之間的比較.第28頁/共139頁噬菌體或病毒是一類非細胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。有的噬菌體基因組較大，如λ噬菌體和T噬菌體等；有的則較小，如M13、f1、fd噬菌體等。其中用感染大腸桿菌的λ噬菌體改造成的載體應(yīng)用最為廣泛。噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為：

1.高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細胞；

2.自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增。第29頁/共139頁λ噬菌體是研究最清楚的大腸桿菌的一種雙鏈DNA溫和噬菌體,也是最早使用的克隆載體之一.λDNA在噬菌體中是線狀DNA分子，全長48.502kb，60個多基因，其中有1/3的區(qū)域是其裂解性生長的非必需區(qū)，這一區(qū)段的缺失，或在此區(qū)段中插入外源DNA，并不影響噬菌體的增殖，這就是λ噬菌體可作為基因載體的依據(jù).其兩端,各有一個長為12bp的互補單鏈(5'-GGGCGGCGACCT-3'),稱為粘性末端.當(dāng)λ噬菌體進入寄主細胞內(nèi)后,其粘性末端能通過堿基互補作用,形成環(huán)狀DNA分子.粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點（cohesiveendsite),它是包裝蛋白的識別位點,λ噬菌體的包裝與DNA特性和其它序列無關(guān),同時對包裝的DNA大小有要求,包裝范圍大約在35kb-51kb.通過改造λ噬菌體,人們發(fā)展了許多不同用途的噬菌體載體.第30頁/共139頁λ噬菌體的基因結(jié)構(gòu)和功能第31頁/共139頁λ噬菌體的生活周期第32頁/共139頁λ噬菌體的改造和構(gòu)建

基因組太大（49kb），酶切點太多，如有5個BamH1位點（G↓GATCC，只能接納一定長度的DNA，即相當(dāng)于λ噬菌體的75-105%，那么只能接納49kb×5%=2.45kb的DNA，重組的λDNA分子難于直接導(dǎo)入宿主細胞.

(1)縮短長度；(2)刪除重復(fù)的酶切位點增加一些單一的酶切位點；(3)加裝選擇標(biāo)記；(4)構(gòu)建琥珀密碼子的突變體，琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。第33頁/共139頁以λ噬菌體為基礎(chǔ)而構(gòu)建的常用載體可分兩類：插入型表達載體和取代型載體

。插入型載體替換型載體第34頁/共139頁λ在Charon載體中克隆外源DNA

第35頁/共139頁λ-DASHII載體的物理圖利用免疫功能正選擇取代型載體第36頁/共139頁λ-DNA作為載體的優(yōu)點1.λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌。2.λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量。3.重組λ-DNA分子的篩選較為方便。第37頁/共139頁1.2.2M13噬菌體載體M13噬菌體顆粒的外形呈絲狀，其基因組DNA長約6.4kb,成熟的噬菌體為閉合環(huán)狀單鏈正鏈DNA.M13單鏈DNA的復(fù)制型是呈雙鏈環(huán)形，此時的DNA可同質(zhì)粒DNA一樣進行提取和體外操作。不論是雙鏈的或是單鏈的M13DNA，均能感染寄主細胞，產(chǎn)生噬菌斑或形成侵染的菌落.第38頁/共139頁M13噬菌體產(chǎn)生單雙鏈DNA的機制第39頁/共139頁作為克隆載體的優(yōu)越性在于能象質(zhì)粒那樣轉(zhuǎn)化進入受體細胞，也可以使用類似于質(zhì)粒分離純化方法制備M13DNA分子，同時又可以采用類似于噬菌體分離純化方法制備單鏈M13DNA，單鏈DNA在序列測定及定位誘變等中極為有用。第40頁/共139頁1.1.3噬菌體DNA的分離純化培養(yǎng)細菌加噬菌體侵染細菌培養(yǎng)細菌注意裂解加氯仿繼續(xù)培養(yǎng)直到細菌全部裂解PEG沉淀噬菌體顆粒分離DNA第41頁/共139頁1.3質(zhì)粒-噬菌體雜合載體1.3.1柯斯質(zhì)粒（Cosmids)它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質(zhì)粒（plasmid）重組而成的載體。cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點、克隆位點、選擇性標(biāo)記以及λ噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細胞。但它不會產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細胞內(nèi)。包裝蛋白識別信號cos位點，與待包裝DNA性質(zhì)無關(guān)，因此用一個質(zhì)粒DNA取代λDNA，就可大幅度地提高外源DNA片段的裝載量。λDNAcos位點及其附近的DNA片段為1.7kb，質(zhì)粒DNA為3.0kb,由此構(gòu)建的Cosmid約為5.0kb,其最大裝載量可達45.9kb。第42頁/共139頁柯斯質(zhì)粒的優(yōu)點：1.具有λ噬菌體的特性(體外包裝，高效感染進入受體細胞)；2.具有質(zhì)粒載體的特性(易于克隆操作、也能轉(zhuǎn)化進入受體細胞、選擇及高拷貝等)；3.具有較高容量（45kb）的克隆能力；4.排斥非重組子；5.不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細胞，不形成噬菌體顆粒，因而不形成噬菌斑。如果通過進一步的分子分析發(fā)現(xiàn)得到的質(zhì)粒是空載體，為什么？第43頁/共139頁第44頁/共139頁為什么柯斯質(zhì)粒慢慢的用的很少或不用了？第45頁/共139頁1.3.2噬菌粒載體(phagemids)

由絲狀噬菌體DNA和質(zhì)粒組成的雜合分子。它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點、選擇性標(biāo)記、多克隆位點等，方便DNA的操作，可在細胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點，在輔助噬菌體的存在下，可進行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。優(yōu)點：A、具有質(zhì)粒性質(zhì)，便于外源DNA的克隆及重組子的篩選；B、提高裝載量；C、較穩(wěn)定。第46頁/共139頁常用的噬菌粒載體pUC18和pUC191.具有較小分子量，可克隆10kb左右的外源DNA片段，并易于進行分離與操作；2.編碼一個ampr基因作為選擇記號便于轉(zhuǎn)化子的選擇；3.拷貝數(shù)高，每個寄主可高達500個，所以只要用少量的大腸桿菌細胞培養(yǎng)物，便可制備出大量的載體DNA；4.存在著一個多克隆位點區(qū)，因此許多種不同類型的外源DNA片段，不經(jīng)修飾便可直接插入到載體分子上；5.由于多克隆位點區(qū)阻斷了大腸桿菌lacZ基因的5’-端編碼區(qū)，可通過化學(xué)顯色反應(yīng)，篩選重組子；

6.lacZ基因是置于lac啟動子的控制之下，這樣插入的外源基因便會以融合蛋白質(zhì)的形式表達；7.含有質(zhì)粒的復(fù)制起點，在沒有輔助噬菌體的情況下，克隆的外源基因可以像質(zhì)粒一樣按常規(guī)的方式，復(fù)制形成大量的雙鏈DNA分子；8.帶有一個M13噬菌體的復(fù)制起點，在有輔助噬菌體感染的寄主細胞中，可以合成出單DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中；9.在pUC18和pUC19這兩個載體中，多克隆位點區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈DNA，另一個則可轉(zhuǎn)錄出負鏈DNA；10.可以直接對克隆的DNA片斷進行核苷酸的序列測定，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟。第47頁/共139頁用于體外轉(zhuǎn)錄T7T3第48頁/共139頁人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，此時柯斯質(zhì)粒(45kb)和噬菌粒載體的裝載量也遠遠不能滿足需要。將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)（著絲粒）、穩(wěn)定區(qū)（端粒）與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。1.4其他載體-人工染色體載體第49頁/共139頁人工染色體載體(artificialchromosomevector)，實際上是一種“穿梭”克隆載體，含有質(zhì)?？寺≥d體所必備的第一受體(大腸桿菌)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(ori)，還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點、端粒和復(fù)制起始位點的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。這樣的克隆載體在第一受體細胞內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式進入高拷貝復(fù)制。這種克隆載體在體外與目的DNA片段重組后，轉(zhuǎn)化第二受體細胞，可在轉(zhuǎn)化的細胞內(nèi)按染色體DNA復(fù)制的形式進行復(fù)制和傳遞。篩選第一受體的克隆子，一般采用抗菌素抗性選擇標(biāo)記；而篩選第二受體的克隆子，常用與受體互補的營養(yǎng)缺陷型。與其他的克隆載體相比，人工染色體克隆載體的特點是能容納長達1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。第50頁/共139頁（1）酵母人工染色體YAC(Yeastartificialchromosome)

包含一個染色體在酵母中繁殖所需的三個序列成分：A、酵母染色體的復(fù)制起點；B、一個著絲粒，保證染色體分離進入后代細胞中；C、端粒，染色體末端封合。還有一個克隆位點和可在細菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因以區(qū)分載體和重組分子以及大腸桿菌的復(fù)制起點。可以接受350-400kb的外源DNA片段。尿嘧啶合成酶關(guān)鍵基因URA3基因

色氨酸合成酶基因TRP1

第51頁/共139頁第52頁/共139頁(2)細菌人工染色體BAC(Bacterialartificialchromosome)以F1質(zhì)粒衍生而來，能克隆約100kb-350kb的外源DNA片段，可以通過轉(zhuǎn)化進入受體細胞，象一般質(zhì)粒制備原理分離。它在大基因組尤其是植物基因組的研究中發(fā)揮重要作用。如構(gòu)建contig，物理作圖等。缺點：會出現(xiàn)插入片段在結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定，導(dǎo)致克隆DNA部分的缺失或重排。第53頁/共139頁2基因工程工具酶2.1限制性核酸內(nèi)切酶(RestrictionEndonuclease,RE)在研究寄主細胞對噬菌體的限制-修飾系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，它能在DNA特異位點上催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生相應(yīng)的限制性片段。大腸桿菌B大腸桿菌K修飾的phageλ(B)EOP=10-4（限制作用）EOP=10-4（限制作用）EOP=1（修飾作用）修飾的phageλ(K)成斑率(EOP,efficiencyofplating)

寄主的限制與修飾現(xiàn)象第54頁/共139頁

限制(restriction)：指一定類型的細菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制，維護宿主遺傳穩(wěn)定的保護機制。

修飾(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾,從而免遭自身限制性酶的破壞,宿主細胞通過甲基化作用達到識別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的。第55頁/共139頁表2-1核酸限制性內(nèi)切酶類型及主要特性特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型（1）限制和修飾活性

（2）酶蛋白分子組成

（3）限制作用所需的輔助因子

（4）特異性識別位點

（5）切割位點

（6）序列特異的切割

（7）在基因工程中的應(yīng)用

雙功能的酶

3種不同的亞基

ATP、Mg2+

非對稱序列

在距識別位點至少1000bp的地方隨機的切割

不是

無用

核酸內(nèi)切酶和甲基化酶分開單一亞基

Mg2+

迴文對稱結(jié)構(gòu)

位于識別位點上

是

廣泛使用雙功能的酶

2種不同的亞基

ATP、Mg2＋

非對稱序列

距識別位點下游24-26bp處

是

用處不大第56頁/共139頁限制性核酸內(nèi)切酶的命名和特征

1973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：1.用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。

2.用一個右下標(biāo)的大寫字母表示菌株或型。如EcoK,EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoRI）。3.如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoRI，EcoRV。

4.限制酶前面要帶上R（Restriction)，修飾酶前面要帶上M（Modification）。(現(xiàn)已省略)。第57頁/共139頁

限制性核酸內(nèi)切酶的命名和特征eg.EcoRIEscherichiacoliR質(zhì)粒第一次發(fā)現(xiàn)HindIIIHaemophilusinfluenzaed株中發(fā)現(xiàn)的第三個酶第58頁/共139頁基本特征①識別序列為4、5或6個堿基對且具有180旋轉(zhuǎn)對稱的回文結(jié)構(gòu)

4bp

HpaⅠ

CCGG

HaeⅢ

GGCC

5bp

AvaⅡ

GGWCC

EcoRⅡ

CCWGG

6bp

BamHⅠ

GGATTC

SmaⅠ

CCCGGG

11bp

Bg1Ⅰ

GCCNNNNNGGC

12bp

BstXⅠ CCANNNNNNTGC

N=A,T,G,C第59頁/共139頁②同位酶：識別相同的序列但切點不同。如XmaI/SmaI

同尾酶：識別位點不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。如MboI/BglII/BamHI,它們切割DNA之后都形成由GATC4個核苷酸組成的粘性末端

BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboINGATCN

同裂酶：識別位點和切割位點均相同的酶。如HpaI/HincII③一般來說，識別序列的堿基對越多，則這種酶在DNA上出現(xiàn)的頻率越低；不同生物堿基含量不同，酶識別位點的分布及頻率也不同。第60頁/共139頁④切開的DNA末端有平頭末端和粘性末端（雙鏈DNA的一條鏈突出，如5′或3′突出末端，在適當(dāng)?shù)臏囟认?，兩個互補粘性末端能退火形成雙鏈分子。Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中3‘位酯鍵產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是5’-P和3’-OH，產(chǎn)生3種不同的切口。第61頁/共139頁5’突出的末端第62頁/共139頁3’突出的末端第63頁/共139頁平頭末端第64頁/共139頁2.2DNA連接酶DNA連接酶廣泛存在于各種生物體內(nèi)，其催化的基本反應(yīng)形式是將DNA雙鏈上相鄰的3′羥基和5′磷酸基團共價結(jié)合形成3′-5′磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA切口重新連接起來，因此它在DNA復(fù)制，修復(fù)以及體內(nèi)體外重組過程中起著重要作用。大腸桿菌連接酶是利用NAD+作為能源的，而T4噬菌體DNA連接酶則是以ATP作為輔助因子。

第65頁/共139頁注：關(guān)于“Gap”與“Nick”的概念。

1.Gap裂或缺口：即DNA裂口，是指雙鏈DNA分子上的某一條鏈?zhǔn)ヒ粋€或數(shù)個核苷酸時所出現(xiàn)的DNA單鏈斷裂。GapinDNAistheabsenceofoneormorenucleotidesinonestrandofduplex.2.Nick切口：雙鏈DNA分子的單鏈斷裂，即在相鄰的2個核苷酸分子之間，失去了(移走了)一個磷酸二酯鏈。NickinduplexDNAistheabsenceofaphosphodiesterbondbetweentwoadjacentnucleotidesononestrand.Nickandgap?1.相鄰的3′羥基和5′磷酸基團;2.配對;3.需要輔基;4平頭末端也可以第66頁/共139頁2.3DNA聚合酶和Klenow大片段酶

DNA聚合酶以一條DNA為模板通過聚合作用把脫氧核苷酸加到雙鏈DNA分子的3ˊ-OH端而合成新的DNA。大腸桿菌DNAPolymeraseI研究得較清楚，單體，具有5′-3′的DNA聚合活性，5′-3′的DNA外切活性和3′-5′的DNA外切活性。用蛋白酶處理大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ產(chǎn)生兩個片段，一個小片段，帶有的5ˊ-3ˊDNA外切酶活性，而另一個較大的片段失去了5ˊ-3ˊDNA外切酶活性但保留了另兩種活性5ˊ-3ˊ聚合酶活性3ˊ-5ˊ外切酶活性，這個大片段被稱為Klenow大片段酶。

第67頁/共139頁2.4堿性磷酸酶細菌的堿性磷酸酶（BAP）和牛小腸的堿性磷酸酶（CIP）均能催化DNA，RNA，核苷酸的5‘端除磷反應(yīng)，因此在DNA重組實驗中，該酶用于載體DNA的5′末端除磷操作以防止載體自身連接，提高重組效率；用于末端標(biāo)記。3’

HO--P5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH堿性磷酸酶5’

P--OH3’

5’

第68頁/共139頁防止線性化的載體份子自我連接第69頁/共139頁2.5末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）該酶來源于小牛胸腺，它是一種不需要模板的DNA聚合酶，其合適的底物形式為帶有3′游離羥基的雙鏈DNA分子,當(dāng)?shù)孜餅?’端突出的雙鏈DNA時，TdT在Mg2+的存在下，即可將脫氧核苷酸隨機聚合在兩條鏈的3′端，對于平頭或3′凹端DNA底物，則需要Co激活，但聚合反應(yīng)仍不按模板要求進行.TdT在人工粘性末端的構(gòu)建中極為有用。第70頁/共139頁2.6S1核酸酶(S1,Nuclease)該酶來源于米曲霉茵，催化反應(yīng)通常由Zn2+激活，并在酸性pH（4.0-4.5）條件下進行，其特征是：（1）降解單鏈DNA或RNA，包括不能形成雙鏈的區(qū)域（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的環(huán)狀部分），但降解DNA的速度大于降解RNA的速度；（2）降解反應(yīng)的方式為內(nèi)切和外切；(3)酶量過大時會伴有雙鏈核酸的降解。因為該酶的雙鏈降解活性比單鏈低7.5萬倍，因此在DNA重組及分子生物學(xué)研究中，S1核酸酶常用來切平突出的單鏈末端以及制作S1圖譜。

(1)測定真核基因中間隔子序列位置；

(2)去除DNA片段中突出的單鏈尾巴；

(3)打開cDNA合成時形成的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。第71頁/共139頁第72頁/共139頁第73頁/共139頁第74頁/共139頁2.7影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（1）DNA的純度一個限制性核酸內(nèi)切酶單位u：在最佳緩沖系統(tǒng)中，在37℃下反應(yīng)1小時完全降解1gDNA所需的酶量。DNA樣品中所含蛋白質(zhì)，有機溶劑以及RNA等雜質(zhì)均會影響酶切反應(yīng)的速度和酶切的完全程度，酶切的底物一般是雙鏈DNA，DNA的甲基化位置會影響酶切反應(yīng)。第75頁/共139頁

大部分II型限制性核酸內(nèi)切酶需要相似反應(yīng)條件：

Tris-HCl50mmol/LpH7.5

MgCl210mmol/L

NaCl0-150mmol/L

DTT1mmol/L

Volume20-100μL

Temperature37℃

Time1-1.5h

（DDT：二硫蘇糖醇BSA：牛血清蛋白)0-50mM低鹽酶100

mM中鹽酶150

mM高鹽酶Buffer第76頁/共139頁完全消化：內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。

加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長反應(yīng)時間局部消化：只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。

通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達到局部消化的目的。第77頁/共139頁(3)鹽離子濃度不同的核酸限制性內(nèi)切酶對鹽離子強度（Na+）有不同的要求，一般按離子強度不同分為低(0-50mM)、中(100mM)、高鹽(150mM)三類。Mg2+也是限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)所需。（2）溫度大部分限制性核酸內(nèi)切酶最適反應(yīng)溫度為37℃，但也有例外，如SmaⅠ的反應(yīng)溫度為25℃,SfiI為50℃

。降低最適反應(yīng)溫度，會導(dǎo)致只產(chǎn)生切口，而不是切斷雙鏈DNA。(4)緩沖體系核酸限制性內(nèi)切酶要求有穩(wěn)定的pH值環(huán)境，這通常由Tris-HCl緩沖體系來完成。另外保持限制性內(nèi)切酶穩(wěn)定和活性一般使用-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）和牛血清白蛋白（BSA）.第78頁/共139頁(5)反應(yīng)體積和甘油濃度商品化的限制性內(nèi)切酶均加50%甘油作為保護劑，一般在-20℃下貯藏。在進行酶且反應(yīng)時，加酶的體積一般不超過總反應(yīng)的10%，若加酶的體積太大，甘油濃度過高，則會影響酶切反應(yīng)。(6)限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的時間通常為1小時，但大多數(shù)酶活性可維持很長的時間，進行大量DNA酶解反應(yīng)時，一般讓酶解過夜。第79頁/共139頁(七)限制性內(nèi)切酶星號活性限制性核酸內(nèi)切酶有特異性識別序列和切割位點，但當(dāng)酶解條件發(fā)生變化時，酶切反應(yīng)的專一性可能會降低，導(dǎo)致同種酶識別多種識別位點，這種現(xiàn)象稱為星號活性。如EcoRI，正常條件下識別GAATTC，但在低鹽，高pH和高甘油存在的情況下，能識別并切割A(yù)AATTC,GAGTTC,GAATTC等。在一個DNA酶切試驗中發(fā)現(xiàn)樣品沒有切動，為什么？第80頁/共139頁第三章基因工程的常規(guī)技術(shù)DNA片段同載體連接導(dǎo)入受體細胞篩選DNA的制備、凝膠電泳、核酸分子雜交、細胞轉(zhuǎn)化、文庫構(gòu)建、PCR擴增技術(shù)、DNA序列結(jié)構(gòu)分析、RNA和蛋白質(zhì)制備分析、DNA蛋白質(zhì)作用分析第81頁/共139頁3．1凝膠電泳技術(shù)以淀粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳，其中聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyzcrylamidegelelectrophoresis,PAGE）普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸，而瓊脂糖凝膠孔徑較大，對一般蛋白質(zhì)不起分子篩作用，但在核酸研究中應(yīng)用廣泛，是一個主要的技術(shù)。第82頁/共139頁3.1.1瓊脂糖凝膠電泳的原理

①分離原理：DNA分子在瓊脂糖凝膠中移動時，有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。前者由分子所帶電荷量的多少而定，后者則主要與分子大小及其構(gòu)型有關(guān)。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動，在用電泳法測定DNA分子大小時，應(yīng)盡量減少電荷效應(yīng)。增加凝膠的濃度可以在一定程度上降低電荷效應(yīng)，使分子的遷移速度主要由分子受凝膠阻滯程度的差異所決定，提高了分辨率。同時適當(dāng)減低電泳時的電壓，也可以使分子篩效應(yīng)相對增強而提高分辨率。第83頁/共139頁②檢測原理：溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，加入的EB就插入DNA分子中形成熒光結(jié)合物，使發(fā)射熒光增強幾十倍，而熒光的強度正比于DNA含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作電泳對照，就可估計出待測樣品的濃度。若用掃描儀檢測，只需要5～10ngDNA，就可以從照片上比較鑒別。如用肉眼觀察，可檢測到0.05～0.1μg的DNA。

第84頁/共139頁上樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。上樣緩沖液有三個作用：

1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；

2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；

3）其中的染料在電場中以可以預(yù)測的泳動速率向陽極遷移。第85頁/共139頁3.1.2瓊脂糖凝膠電泳的條件影響

①DNA分子的遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。②隨著電場的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍縮小，即分辨率降低。③DNA分子在TAE和TBE等緩沖液中帶負電荷，在電場中向正極移動。④瓊脂糖濃度。采用不同的凝膠能分辨不同分子量的DNA分子。⑤電場方向。電場方向改變，DNA分子被迫改變路徑，DNA分子越大，為適應(yīng)新的電場方向而重新排列所需的時間就越長。因此可以通過脈沖電場凝膠電泳來分辨極大的DNA分子。第86頁/共139頁☆能定性定量DNA、能知道DNA分子量，能大約知道DNA的純度情況。第87頁/共139頁第88頁/共139頁

DNA變性

1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性

2、變性的方法：1）熱變性：溫度升高到90-100℃時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。DNA復(fù)性

1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。復(fù)性過程：1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈

2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離

3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列

4）形成完整的雙鏈分子第89頁/共139頁3．2核酸的分子雜交技術(shù)3.2.1探針標(biāo)記帶有能檢測的標(biāo)記物的DNA或RNA叫探針。使DNA或RNA帶有可檢測的標(biāo)記物的過程叫探針標(biāo)記。①切口平移標(biāo)記控制DNaseI的濃度，就可以在雙鏈DNA分子的一條鏈的有限位置上打開切口，形成3-OH末端（這條鏈即成為引物）。DNA聚合酶I把一個帶有標(biāo)記物的dNTP就加在這引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性將切除5-單核苷酸，同時依次添加新的核苷酸到3一側(cè)，其結(jié)果使切口沿著DNA平移，這就叫切口平移（Nicktranslation)第90頁/共139頁第91頁/共139頁②隨機引物標(biāo)記能與任何DNA配對互補的一小段DNA序列叫隨機引物。DNA聚合酶klenow大片段能在隨機引物的引導(dǎo)下以帶有標(biāo)記物的dNTP為原料合成新的與模板DNA互補的探針?！?/p>

RNA的標(biāo)記、DNA末端標(biāo)記、PCR標(biāo)記☆

放射標(biāo)記和飛放射標(biāo)記第92頁/共139頁3.2.2核酸的分子雜交①Southernblot

Southern雜交技術(shù)由E.Southern于1975年發(fā)明，它現(xiàn)在是基因分離和鑒定中不可缺少的一個重要手段。待分析的基因組DNA或其它DNA首先用一種或幾種限制性核酸內(nèi)切酶消化，消化后的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳按照分子量的大小進行分離，凝膠經(jīng)堿變性處理，將DNA分子變性成單鏈，經(jīng)毛細管作用或物理方法將凝膠中的單鏈DNA分子從膠上轉(zhuǎn)移到固相支持物上（一般使用的是尼龍膜和纖維素膜）。然后用標(biāo)記的DNA或RNA探針對附著于膜上的DNA進行雜交來檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，與探針有同源性的DNA片段在膜上的位置可以通過特定的檢測方法如放射自顯影或顯色而顯示。第93頁/共139頁Southernblot原理第94頁/共139頁Southern雜交能否檢出雜交信號取決于很多原因,其中包括目的DNA在總DNA中所占的比例、探針的大小和比活性、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA之間的配對情況等。怎樣知道DNA轉(zhuǎn)移成功或高效地轉(zhuǎn)移了？解決的措施？第95頁/共139頁一個Southernblot雜交應(yīng)用的例子：ChromosomeconstitutionofNullisomic-tetrasomicline

Nulli1ATetra1B[NT1A(1B)]1234567ABDSinglebreakterminaldeletionlinesCCCDL-1DL-2DL-3DL:DeletionLinefor1BSProbeAProbeBProbeC第96頁/共139頁1234567ABDChromosomeconstitutionofditelosomic1AL第97頁/共139頁FinePhysicalmappingofgroup1inwheatDABDABN1AT1BN1BT1DN1DT1ACS1AS-31AS-41AS-11AS-21AS-51BS-41BS-181BS-191BS-221BS-21BS-61BS-131BS-81BS-161BS-71BS-31BS-101BS-151BS-211BS-11DS-51DS-41DS-11DS-21DS-31AL-31AL-41AL-51AL-21AL-11BL-101BL-131BL-31BL-51BL-121BL-151BL-81BL-91BL-21BL141BL-11BL-71BL-161BL-61BL-111DL-21DL-31DL-11DL-4DT-1ASDT-1ALDT-1BSDT-1BLDT-1DSDT-1DLProbeused:BCD921FL0.42FL0.17FL0.47FL0.32FL0.41第98頁/共139頁②Northernblot和Westernblot轉(zhuǎn)移RNA，然后進行雜交Northernblot轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)，然后進行雜交Westernblot③菌落（或噬菌斑）原位雜交把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后溶菌變性并固定DNA，最后用標(biāo)記的DNA或RNA探針進行雜交來檢測這些被轉(zhuǎn)移的菌落或噬菌斑。第99頁/共139頁3.3文庫構(gòu)建

基因文庫（genelibrary)或DNA文庫：在細菌中增殖來自某一生物的染色體基因組DNA（或來自所有不同的mRNA種的每一種cDNA分子）所形成的的全部DNA片段之集合體。有基因組DNA文庫(克隆)和cDNA文庫(克隆)。第100頁/共139頁基因組DNA克隆(文庫）某種生物總基因組DNA片段和某一載體形成的克隆或文庫。cDNA克隆文庫來自某一生物的某種組織的所有不同的mRNA合成的cDNA分子再將cDNA重組到載體上，導(dǎo)入大腸肝菌細胞增殖。第101頁/共139頁3.3.1基因組文庫DNA克隆片段的產(chǎn)生與分離①基因組DNA的片段化限制性核酸內(nèi)切酶和機械切割法②

DNA片段大小分離和富集瓊脂糖凝膠電泳和蔗糖梯度離心技術(shù)第102頁/共139頁重組DNA導(dǎo)入受體細胞轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化（transformation):感受態(tài)的大腸桿菌捕獲和表達外源質(zhì)粒DNA分子的過程；轉(zhuǎn)染（transfection):感受態(tài)的大腸桿菌捕獲和表達外源噬菌體DNA分子的過程。感受態(tài)：細菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。第103頁/共139頁（1）受體細胞的選擇A、限制缺陷型；B、重組缺陷型；C、遺傳互補型；D、感染寄主缺陷型（2）轉(zhuǎn)化過程感受態(tài)細胞的制備受體細胞和DNA混合熱激表達轉(zhuǎn)化子（3）轉(zhuǎn)化影響因素

A、DNA；B、受體細胞；C、操作第104頁/共139頁基因文庫的質(zhì)量N=ln(1-P)/ln(1-f)N為一個完整基因文庫所應(yīng)包含的重組DNA的轉(zhuǎn)化子克隆數(shù)；P為在重組體群體中出現(xiàn)目的基因序列的幾率（一般期望值為99％）；f為限制片段的平均大小與基因組DNA大小之比。比如人單倍體基因組大小為3X109bp，若載體裝載量為20kb,那么為了保證目的基因序列以99％的幾率在重組體群體中出現(xiàn)則需要重組子克隆數(shù)為69萬。第105頁/共139頁3.3.2cDNA文庫(1)cDNA文庫的構(gòu)建A、分離總RNA，然后從中純化mRNA。B、合成第一cDNA鏈。C、將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA分子。D、將合成的雙鏈cDNA重組到載體上，導(dǎo)入大腸肝菌細胞增殖。第106頁/共139頁（2）cDNA克隆的優(yōu)越性A、一些RNA病毒基因克隆的唯一手段。B、文庫篩選較簡單。C、假陽性幾率低。D、生產(chǎn)表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)。E、功能研究。第107頁/共139頁3.3.3基因克隆的實驗方案

A.鳥槍法某種生物總DNA片段的隨機克隆，以及隨后對含有克隆的細菌菌落或噬菌斑的鑒別，通常要從幾百至幾千菌落或噬菌斑中辨別出一個克隆。第108頁/共139頁B.基因圖位克隆（map-basedcloning)用于分離其編碼產(chǎn)物尚不知道的目的基因的一種有效方法。條件：有高密度的分子標(biāo)記遺傳圖譜和對應(yīng)的物理圖。其原理是：在目的基因的兩側(cè)確定一對緊密連鎖的RFLP或其他分子標(biāo)記，接著利用最緊密連鎖的一對兩側(cè)分子標(biāo)記作探針，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個分子標(biāo)記之間的含目的基因的特定基因組片段克隆并分離出來，最后鑒定出目的基因。原理和過程？第109頁/共139頁(1)RFLP分子標(biāo)記和作圖RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism),即DNA限制片段長度多態(tài)性，它是指應(yīng)用特定的核酸限制性內(nèi)切酶切割有關(guān)的DNA分子，所產(chǎn)生出來的DNA片段在長度上的簡單變化。由于不同來源的植株DNA分子中間已經(jīng)發(fā)生了堿基對的取代，缺失，插入或重排等變化，其中有些變化導(dǎo)致了限制性酶切位點的變動而形成RFLP。第110頁/共139頁(2)染色體步移（chromosomewalking)根據(jù)高密度的分子標(biāo)記遺傳圖譜，利用在目的基因的兩側(cè)最緊密連鎖的一個或一對分子標(biāo)記作探針，通過篩選基因組文庫分離出陽性克隆，以陽性克隆的末端單拷貝序列為探針再篩選基因組文庫分離出陽性克隆，并通過DNA指紋分析將分離出的基因組克隆重疊連接在一起形成重疊群。如此重復(fù)多次直到克隆重疊群覆蓋目的基因。這種技術(shù)稱為染色體步移。第111頁/共139頁第112頁/共139頁Fig.

Subgenomechromosomewalkingonchromosome1AmS.(A)High-resolutiongeneticmapoftheLr10locusonchromosome1ASofhexaploidwheatderivedfrom3120

F2plantsofacrossbetweenThLr10andFrisal.Sixofthe12

probesderivedfromT.monococcumBACsareshownandunderlined.Theremaining6

probeswerederivedfromBAC111I4and640L20,andallofthemcosegregatedwiththeLr10gene.ProbenamesbeginningwithanFrepresentPCRproductsderivedfromspecificregionsofeitherBACends(F640)orshotgunclones(F241,F467).ProbenamesbeginningwithHSrepresentinsertsfromshotgunclones,whichweredirectlyusedasRFLPprobes.4E14RistherightBACendof4E14derivedbyplasmidrescue.Geneticdistancesareincentimorgans(cM).(B)PhysicalcontigattheMWG2245locusindiploidT.monococcum(DV92).Thetotalcontiglengthisabout450

kb.LeftandrightendsofBACclonesareindicatedasLandR,respectively.Probesforwhichthephysicallocationisonlyapproximatelyknownaremarkedwithanasterisk第113頁/共139頁C.差別雜交(differentialhybridization)用來篩選特異mRNA的cDNA克隆,它不需要任何有關(guān)目的基因的核苷酸序列信息，但需要有兩種不同的細胞群體：在一個細胞群體中目的基因正常表達，而在另一細胞群體中不表達。差別雜交分離目的基因的原理：a、從兩種來源的細胞群體制備mRNA；b、用來源于表達目的基因的細胞群體的mRNA逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA文庫；c、用兩種細胞群體制備的mRNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA標(biāo)記探針；第114頁/共139頁d、用這兩種cDNA探針分別對文庫進行雜交并比較雜交信號：在含有目的基因的cDNA探針雜交平板上出現(xiàn)的菌落而在不含目的基因的cDNA探針探針雜交平板上不出現(xiàn)，這種菌落即可能是目的基因克隆。第115頁/共139頁

3.4PCR擴增（PolymeraseChainReaction)第116頁/共139頁WhatisPCR?

DNAreplicationgonecrazyinatube!MakesmanycopiesoftargetsequencefromtemplateDNAUsesheat-resistantTaqpolymerasefromThermusaquaticus又稱為聚合酶鏈反應(yīng),由Mullis于1983年發(fā)明，能在體外特異快速擴增DNA片段。組成：DNA單鏈模板、引物和DNA聚合酶（包括緩沖液）第117頁/共139頁WhatisneededforPCR?Template(theDNAyouwanttoamplifyforthestudy)Sequence-specificprimersflankingthetargetsequenceForwardReverseNucleotides(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)Magnesiumchloride(enzymecofactor)Buffer,containingsaltTaqpolymerase第118頁/共139頁A、TaqDNA聚合酶熱穩(wěn)定的聚合酶，1988年分離到。催化一典型的PCR反應(yīng)所需酶量約為2單位，加酶量過多則有可能導(dǎo)致非靶序列的擴增。B、引物引物是保證PCR特異性的關(guān)鍵因素，一般使用兩個引物來擴增專性序列。設(shè)計原則：①長度15-30個核苷酸；②G+C含量應(yīng)在45%-55%；③堿基分布的隨機性；④引物不能含有自身互補序列；⑤兩個引物之間不應(yīng)有多于4個互補堿基。引物貯備液濃度一般為20M（或10-50M），使用濃度一般為1mol/L(1M),這一濃度足以完成30個循環(huán)的擴增反應(yīng)。過高，不經(jīng)濟且會出現(xiàn)非特異序列擴增及增加引物二聚體的產(chǎn)生；第119頁/共139頁過低，則PCR的效率低。C、反應(yīng)緩沖液Mg2+:可顯著影響PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性，一般用量為1.5mM。過高則出現(xiàn)非特異擴增，過低則酶活性顯著下降。明膠，BSA，Tween20及DTT:對酶有一定的保護作用。Tris-Cl:PH8.3,提供緩沖環(huán)境。D、dNTPdATP,dGTP,dCTP和dTTP貯備液濃度均為5mM，保存于-20℃，使用濃度為200M。過低則反應(yīng)速度下降，過高則特異性下降。第120頁/共139頁E、反應(yīng)條件變性溫度和時間：保證模板DNA解鏈完全是保證整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。復(fù)性溫度和時間：PCR反應(yīng)的特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合，一般為40-60℃.越高,產(chǎn)物的特異性也越高。