第十三章體外受精與核移植動物

為什么要進行動物人工繁殖？1）野外大熊貓到了圈養(yǎng)環(huán)境中繁殖率非常低，78%的雌性大熊貓不孕，圈養(yǎng)大熊貓90%的雄性大熊貓不育。2）野生中華鱘產(chǎn)卵場分布在金沙江下游和長江上游的約600公里江段。葛洲壩、三峽大壩阻斷了洄游路線，為了補償對中華鱘造成的不利影響，我國在宜昌成立了中華鱘研究所,人工繁殖的幼鱘，投放長江。3）對于人類，世界范圍內(nèi)不孕夫婦占10％左右，需要建立人工助孕技術(shù)。第一頁，共90頁。所有的這一切，都必須依賴于動物細胞工程，尤其是胚胎工程和核移植技術(shù)。第二頁，共90頁。精、卵人工授精體外受精體內(nèi)發(fā)育早期胚胎胚胎移植受體動物在受體子宮發(fā)育出生胚胎冷凍胚胎分割、融合體/胚胎細胞卵母細胞核移植體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)精、卵有性生殖無性生殖動物細胞工程第三頁，共90頁。胚胎工程：是指對動物早期胚胎或配子進行的工程技術(shù)操作，獲得所需要的成體動物的技術(shù)。包括體外受精、胚胎移植、胚胎分割與融合、胚胎/精子/卵子冷凍保存、胚胎性別控制、胚胎細胞核移植、基因?qū)氲取?/p>

第一節(jié)胚胎工程第四頁，共90頁。胚前期：受精—第2周末受精、卵裂、形成胚泡。胚期：第3周—第8周末三胚層的形成和分化，各主要器官原基的建立胎期：第9周—出生第五頁，共90頁。體外受精動物(試管動物)：將供體的精子和卵子在體外受精、體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育到一定階段，通過胚胎移植移入受體完成發(fā)育出生的動物。體外受精：哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)。

第二節(jié)體外受精動物第六頁，共90頁。

發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力

一頭優(yōu)良品種母牛的卵巢內(nèi)有幾萬個生殖細胞，但在一個正常性周期內(nèi)只有幾個卵泡同時發(fā)育，而最終只有一個卵泡成熟并排卵，如果受精也只能生出一只良種牛犢。一只良種母畜一生只可能繁殖10個左右的后代，大部分時間用于妊娠和哺乳。如果能讓更多的卵泡成熟排卵，而又讓品質(zhì)平凡的同種母畜“借腹懷胎”，優(yōu)良母畜可以獲得后代的數(shù)目至少增加幾十倍。意義第七頁，共90頁。促進家畜改良的速度由于提高了繁殖能力，可以使一頭母畜在一個性周期內(nèi)繁殖更多的仔畜，從而在短期內(nèi)使優(yōu)良種畜得到大量繁殖，促進了家畜改良的速度。保存遺傳資源

對優(yōu)良母畜或稀有哺乳動物有計劃地保存胚胎，建立起“胚胎庫”。異地移植只需運輸冷凍胚胎即可，而且可以有計劃地進行胚胎采集和移植，優(yōu)良胚胎的利用率就會大大提高。第八頁，共90頁。①精子采集與體外獲能、卵子采集與成熟培養(yǎng)；②體外受精；③重組胚激活與體外培養(yǎng)；④胚胎移植；⑤體內(nèi)發(fā)育、出生。體外受精動物培育的步驟第九頁，共90頁。采集精子并選擇有活力的精子精子的體外獲能：是指精子獲得穿卵子透明帶能力的過程。采用添加誘導(dǎo)精子獲能物質(zhì)(鈣離子、血清蛋白、肝素等)的特定培養(yǎng)液來完成精子體外獲能。

1、精子的采集與體外獲能第十頁，共90頁。精子的結(jié)構(gòu)頭部：頂體、細胞核尾部：頸、中段、主段和末端。頂體內(nèi)部含有水解酶，能協(xié)助精子穿入卵周圍的卵膜。精子質(zhì)膜外表面存在有多種凝集素受體。鞭毛為9＋2微管結(jié)構(gòu)精子在睪丸生精小管內(nèi)產(chǎn)生，是單倍體。第十一頁，共90頁。(一)成熟卵細胞的收集

超數(shù)排卵：利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，利用手術(shù)取出卵母細胞。目的是最大限度地利用母畜的生殖能力（牛超數(shù)排出5-10個卵母細胞）卵細胞的收集：在腹腔鏡下用吸管吸出卵細胞。

2、卵細胞的回收與成熟培養(yǎng)第十二頁，共90頁。卵子的結(jié)構(gòu)卵細胞內(nèi)部物種空間分布具有極性，卵內(nèi)組分沿著卵的主軸分布不均勻，形成動物級和植物級。卵黃積聚在植物級卵細胞質(zhì)分布在兩個固定的區(qū)域，質(zhì)膜下細胞質(zhì)稱為皮層，皮層是高度粘滯、半硬的凝膠狀，內(nèi)含有皮層顆粒和色素顆粒。大部分卵細胞質(zhì)——內(nèi)質(zhì)是液體狀態(tài)，內(nèi)含線粒體和生殖質(zhì)。卵細胞排出卵巢后，有卵膜包被

第十三頁，共90頁。卵子的發(fā)生在哺乳類，所有卵原細胞成熟和卵原細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槁涯讣毎窃谔悍置淝巴瓿伞Ｂ涯讣毎纬呻A段是從胎兒誕生開始一直到性成熟排卵為止。直到青春期卵母細胞才進行生長，以后每個性周期后有一批新的卵母細胞繼續(xù)發(fā)育，而多數(shù)卵母細胞在每個周期發(fā)育中未成熟就退化。第十四頁，共90頁。卵細胞從卵巢排出的卵子，處于減數(shù)第二次分裂的中期，卵子進入輸卵管，待受精后才完成第二次成熟分裂。

第十五頁，共90頁。(二)卵母細胞的收集、選擇與成熟培養(yǎng)

活體卵巢采集；屠宰后家畜的卵巢中采集。卵母細胞的選擇:分A（三層以上卵丘細胞，卵母細胞質(zhì)均勻）B（卵丘細胞低于三層，卵母細胞質(zhì)均勻)、C（裸露卵母細胞）和D（死亡或退化卵母細胞）四個等級，一般選擇A級和B級卵母細胞。

第十六頁，共90頁。卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)成熟的標志：生發(fā)泡破裂；染色體凝集；極體排出；透明帶軟化；卵丘細胞擴展。第十七頁，共90頁。精卵放在一起培養(yǎng)①共培養(yǎng)體外受精：②顯微受精技術(shù)：透明帶下注射法、卵漿內(nèi)精子注射法、透明帶修飾法。受精卵是否可以發(fā)育至囊胚是受精是否成功的標志。

3、體外受精第十八頁，共90頁。精子和卵子經(jīng)過受精作用形成受精卵，受精卵經(jīng)過卵裂、形成囊胚，囊胚進一步發(fā)育進入原腸胚階段，形成不同胚層，再產(chǎn)生器官原基，進一步產(chǎn)生個體。第十九頁，共90頁。體外受精第二十頁，共90頁。受精卵需在體外培養(yǎng)發(fā)育至桑椹期或囊胚期才能進行移植。移植的較佳時期是發(fā)育至8-16細胞期的胚胎。

4、胚胎培養(yǎng)第二十一頁，共90頁。卵裂：合子發(fā)生分裂形成若干小細胞。卵裂細胞不生長而連續(xù)分裂。主要是卵裂球的有絲分裂器與表層胞質(zhì)變化的過程。桑椹胚：卵裂數(shù)次后，出現(xiàn)實心細胞團，形似桑椹得名。受精卵在進行卵裂的同時，逐漸向子宮腔移動。受精后72小時，桑椹胚進入子宮腔。第二十二頁，共90頁。卵巢第二十三頁，共90頁。胚泡：哺乳動物的胚胎處于16細胞期的桑椹期時，胚胎是球型細胞團，細胞之間形成充滿液體的腔隙，然后它們聯(lián)合形成一個大腔位于胚胎的一端，即為胚泡結(jié)構(gòu)。囊胚：桑椹胚隨著卵裂出現(xiàn)充滿液體的囊胚腔，圍繞囊胚腔的細胞組成囊胚層。原腸胚：囊胚繼續(xù)發(fā)育、分化，形成雙胚層或三胚層的原腸胚。外層為外胚層、遷到里面的稱為內(nèi)胚層和中胚層。胚泡腔內(nèi)細胞群第二十四頁，共90頁。哺乳動物胚泡著床內(nèi)細胞團：在胚泡胚極一端，能夠發(fā)育成為胚胎主體的一團細胞。滋養(yǎng)層細胞：外層發(fā)育成為胎盤的細胞。著床：或叫植入，胚泡和子宮壁相互接觸并侵入子宮組織的過程。時間：在受精后5～6天開始，至11～12天完成

部位：通常在子宮底部或體部

第二十五頁，共90頁。胚泡桑椹胚4細胞2細胞卵裂受精排卵排卵、受精與卵裂過程第二十六頁，共90頁。

5－8周人胚外形演變第二十七頁，共90頁。第二十八頁，共90頁。概念：是指將發(fā)育到一定階段的胚胎移植到與供體同時發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的“受體”母畜輸卵管或子宮的技術(shù)。供體：提供胚胎的個體。受體：接受胚胎的個體。

“借劣質(zhì)動物之腹懷優(yōu)秀個體之胎”胚胎的來源：◆體外受精、培養(yǎng)的胚胎◆經(jīng)超排、輸精（體內(nèi)人工受精）后，回收的早期胚胎移植的方法：有手術(shù)法（小型家畜）和非手術(shù)法（大型家畜）

5、胚胎移植第二十九頁，共90頁。我國從20世紀70年代開始胚胎移植的研究，先后在山羊（1974年）、牛（1978年）、家兔（1979年）上獲得成功。

中國首例胚胎移植的藏獒第三十頁，共90頁。胚胎分割：借助顯微操作技術(shù)或徒手操作方法，切割早期胚胎成2、4等多等份，再移植給受體母畜，從而制造同卵多仔后代的技術(shù)。胚胎分割是擴大胚胎利用率的一種有效途徑。胚胎分割技術(shù)不僅可以使胚胎移植的胚胎數(shù)目成倍增加，而且可以產(chǎn)生遺傳性狀相同的后代，因此是一種廣義上的克隆技術(shù)。胚胎分割與胚胎融合第三十一頁，共90頁。第三十二頁，共90頁。胚胎融合：又叫胚胎嵌合，是將兩枚或兩枚以上的胚胎（同種或異種動物）的部分或全部細胞融合在一起，使之發(fā)育成一個胚胎，然后移植到受體母畜體內(nèi)讓其繼續(xù)發(fā)育形成一種嵌合體后代的技術(shù)。將同一種類的黑鼠和白鼠胚胎融合，可以獲得多個黑白相間的花鼠。將不同種的綿羊和山羊的胚胎融合，可得到擁有綿羊和山羊雙重特性的新品種——“綿山羊”。大鼠-小鼠、綿羊-山羊、馬-斑馬、黃牛-水牛等屬間嵌合體動物。第三十三頁，共90頁。異種嵌合體：山羊－綿羊第三十四頁，共90頁。囊胚注射法：把某些種類細胞（卵裂球、內(nèi)細胞團細胞、胚胎干細胞，甚至是已經(jīng)分化的細胞）注射入囊胚的囊胚腔中。胚胎融合的方法聚合法：兩個不同的桑椹胚去透明帶后聚合。第三十五頁，共90頁。為動物胚胎發(fā)育及遺傳控制等研究提供了有效手段可以形成具有高度雜種優(yōu)勢的雜合體不僅可成倍縮短家畜改良時間，而且也為創(chuàng)造新型的家畜品種提供新的技術(shù)手段（如生產(chǎn)具特殊皮毛特性的新品種）胚胎融合的意義第三十六頁，共90頁。1978年世界首例試管嬰兒在英國成功。1983年，澳大利亞創(chuàng)造了世界第一個冷凍試管嬰兒。1984年，澳大利亞誕生了一胚4胎的試管嬰兒，創(chuàng)造了世界多胚胎試管嬰兒的記錄。第三節(jié)試管嬰兒世界上第1例試管嬰兒LouisBrown

在英國誕生第三十七頁，共90頁。試管嬰兒：體外受精結(jié)合胚胎移植技術(shù)（IVF-EF），分別將卵子和精子取出后體外受精，發(fā)育成胚胎后再植回母體子宮內(nèi)發(fā)育、出生獲得嬰兒的技術(shù)。第三十八頁，共90頁。

現(xiàn)在全世界范圍內(nèi)已出生數(shù)以萬計，妊娠成功率都有迅速的提高,妊娠率提高到20-30%。我國在這方面的工作相對起步較晚，1985年我國臺灣省出生第1例試管嬰兒，1986年香港也出生1例。大陸首例試管嬰兒于1988年3月10日在北大三院誕生。她的母親是一位38歲、原發(fā)不孕20年、雙側(cè)輸卵管不通的患者。第三十九頁，共90頁。中國雙胞胎試管嬰兒第四十頁，共90頁。三個階段的試管嬰兒第一代試管嬰兒1977年Steptoe和Edwards創(chuàng)造的常規(guī)試管嬰兒為第一代試管嬰兒。第四十一頁，共90頁。第一代“試管嬰兒”正確的稱呼應(yīng)該是體外受精和胚胎移植，將卵子和精子先分別在玻璃器皿中培育兩天，然后讓卵子受精，待受精卵分裂成有4-8個細胞的早期胚胎，再移植入人的子宮內(nèi)繼續(xù)生長發(fā)育直至分娩。目前全球已誕生了數(shù)十萬“試管嬰兒”。第一例“試管嬰兒”是1978年英國專家定制了世界上第一個試管嬰兒名叫露易絲-布朗，已婚。第一代“試管嬰兒”主要適合于輸卵管堵塞，子宮內(nèi)膜異位癥等引起的不孕癥患者。全部過程手術(shù)費及藥費約15000元。第四十二頁，共90頁。第二代試管嬰兒

1992年P(guān)alermo的單精子注射卵細胞漿內(nèi)（ICSI）是第二代試管嬰兒。通過先進的顯微注射儀將單個精子注射進卵細胞內(nèi)使其受精，因此這種方法又稱為顯微受精。第二代試管嬰兒的技術(shù)關(guān)鍵在于顯微操作系統(tǒng)與注射技術(shù)的建立等。第四十三頁，共90頁。第二代“試管嬰兒”正確的稱呼是胞質(zhì)內(nèi)單精子注射。這是一種精確而細巧的技術(shù)，需要在顯微鏡下操作。國內(nèi)醫(yī)學界將ICSI稱為第二代試管嬰兒技術(shù)。ICSI不僅提高了成功率，而且使試管嬰兒技術(shù)適應(yīng)癥大為擴大，全部過程手術(shù)費及藥費約18000元--20000元。此項技術(shù)的成功率45%--50%。第四十四頁，共90頁。第三代試管嬰兒

通過種植前遺傳學診斷（PGD）技術(shù)培育出的試管嬰兒將被稱為第三代試管嬰兒。從體外受精的胚胎取出部分細胞進行基因診斷，排除帶致病基因的胚胎后再進行移植，從而實現(xiàn)胚胎著床前即診斷出遺傳病癥的愿望。1990年，世界首例PGD試管嬰兒成功培育。第四十五頁，共90頁。第三代“試管嬰兒”實際上側(cè)重于胚胎著床前的遺傳診斷。與第一、二代“試管嬰兒”一樣，要經(jīng)過體外受精獲得胚胎。當胚胎發(fā)育到4-8個細胞的胚胎時，鏡下取出1或2個細胞（醫(yī)學上通常稱為分裂球）進行遺傳學檢查，并保持其完整性。如果明確胚胎沒有遺傳病，再將它移植到人的子宮內(nèi)，使之繼續(xù)生長發(fā)育。在1989年已取得成功。人群中有1/5-1/4患有遺傳性疾病，平均每人攜帶5-6個隱性基因，若能夠在胚胎移植前就明確有無遺傳性疾病，將大大提高出生后嬰兒的質(zhì)量。第四十六頁，共90頁?！艚柚鷦e人卵漿增強自己卵子活力◆特征：卵漿置換◆主要針對那些卵子質(zhì)量不高、活力差的高齡女性。第四代試管嬰兒第四十七頁，共90頁。第四代“試管嬰兒”是卵漿置換技術(shù)的簡稱。2003年6月5日，武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心為40歲的李女士成功進行卵漿置換手術(shù)，標志第四代“試管嬰兒”首次在我國成功運用。手術(shù)中醫(yī)生通過顯微鏡將李女士卵子內(nèi)的卵漿與另一健康女性的卵漿置換，增強其卵子活力，與其丈夫的精子體外結(jié)合，受精卵再移入體內(nèi)。第四十八頁，共90頁。世界試管嬰兒誕生記錄

１９７８．７．２５英國女世界第一個試管嬰兒

１９７８．１０．３印度女印度第一個

１９７９．１．１４英國男第一個男性嬰兒

１９７９．６．２３澳洲女澳洲第一個

１９８０．６．６澳洲一男一女首例試管嬰兒雙胞胎

１９８１．１０．１９英國女第一個黑白混血兒試管嬰兒

１９８１．１２．２８美國女美國第一個

１９８２．９．２２以色列女以色列第一個

１９８２．９．２７瑞典女瑞典第一個

１９８３．５．２０新加坡男東南亞第一個試管嬰兒

１９８３．６．８澳洲二女一男首例三胞胎

１９８４．１．１６澳洲四男首例四胞胎第四十九頁，共90頁。１９８５．４．１６中國臺灣男臺灣首例試管嬰兒

１９８８．３．１０中國大陸女中國大陸首例試管嬰兒

北醫(yī)大三院

１９８９．８．２６中國大陸男中國大陸首例三胞胎

北醫(yī)大三院１９９２．６．１２中國大陸男中國大陸首例贈卵試管嬰兒

北醫(yī)大三院

１９９５．２．６中國大陸女中國大陸首例凍融胚胎試管嬰兒

北醫(yī)大三院第五十頁，共90頁。女方超排卵與取卵精子采集與體外獲能處理體外受精受精卵體外培養(yǎng)胚胎移植胚胎移植（選擇8細胞胚胎）與觀察子宮內(nèi)發(fā)育、嬰兒誕生

試管嬰兒（第一代）技術(shù)步驟第五十一頁，共90頁。

第四節(jié)核移植動物第五十二頁，共90頁。細胞核移植:是利用顯微操作技術(shù)將一種動物的細胞核移入同種或異種動物的去核成熟卵細胞內(nèi)的技術(shù)。細胞核移植動物又稱克隆動物:用特定發(fā)育階段的核受體體外構(gòu)建重組胚，通過胚胎移植到受體完成發(fā)育出生的動物。包括胚胎細胞克隆動物和體細胞克隆動物。

第五十三頁，共90頁。發(fā)展歷程1952年，美國人羅伯特.布里格斯對豹蛙發(fā)育到囊胚期的胚胎細胞做移核試驗，成功地獲得了一個可以攝食的豹蛙幼體。

1958年到1962年，英國劍橋大學利用爪蟾原腸內(nèi)胚層細胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾。使用最多的克隆方法——胚胎細胞克隆第五十四頁，共90頁。1996-1997年首只體細胞克隆動物“多莉”羊的成功證明了成熟的體細胞核也具有全能性。里程碑式的突破第五十五頁，共90頁。CreatingDolly！1997年2月22日，英國“Nature”刊登了愛丁堡羅斯林研究所維爾穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，從此震驚了世界。第五十六頁，共90頁。多莉的生命歷程1998年4月與威爾士山羊戴維產(chǎn)下邦尼，證明了克隆動物也能生育。2003.2.14日蘇格蘭向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫實施了安樂死。由于早衰問題，人們懷疑“多莉是穿著羔羊服裝的老羊”。第五十七頁，共90頁。1、核供體細胞的選擇（胚胎細胞/胚胎干細胞/成體細胞）與細胞核的獲得。2、核受體細胞的選擇（成熟的卵母細胞）與細胞核的去除（顯微去核/射線去核/化學法去核）。3、細胞核移植：將供體核移植入已去核的受體細胞內(nèi)常用方法直接(胞質(zhì)內(nèi))注射和透明帶下注射兩種方法4、重組胚泡的激活(電激活和化學激活)。

1、細胞核移植動物培育流程第五十八頁，共90頁。5、重組胚的培養(yǎng)和移植

激活的重組胚桑椹胚/囊胚胚胎移植6、體細胞核移植后代的鑒定體外培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)第五十九頁，共90頁。使用最多的克隆方法胚胎細胞分化程度低，容易成功。

2、胚胎細胞核移植克隆動物第六十頁，共90頁。核移植小鼠（1981年1月Science雜志）第六十一頁，共90頁。真正意義的克隆

——體細胞克隆

3、體細胞克隆動物第六十二頁，共90頁。第六十三頁，共90頁。應(yīng)用與意義

1、檢驗動物細胞全能性

2、加速動物繁殖、優(yōu)良育種、保護珍貴動物

3、利用轉(zhuǎn)基因克隆動物進行生物藥物的生產(chǎn)

4、異種器官移植（結(jié)合特異基因的敲除）

5、治療性克?。梢杂没颊弑救思毎嘤鲂陆M織）

第六十四頁，共90頁。有關(guān)克隆動物與人存在的問題？第六十五頁，共90頁。1、技術(shù)尚不成熟得到的克隆動物具有極大的偶然性和隨機性。迄今為止，克隆試驗的成功率始終很低。例如，在培育多莉的過程中，科學家共克隆出277個綿羊胚胎，最終成功使母羊受孕并生產(chǎn)的只有多莉一個。目前，多莉羊的制備還不能重復(fù)，更不能肯定克隆多莉羊的方法也適用于其它動物或其它不同組織器官的細胞。第六十六頁，共90頁。2、遺傳、疾病問題

克隆動物夭折率高，不少克隆動物天生患有疾病或體形過大。克隆動物沒有遺傳物質(zhì)的交流和互補，將會加劇一些遺傳疾病的發(fā)生。

第六十七頁，共90頁。3、社會、倫理學問題第六十八頁，共90頁。社會關(guān)系父子？兄弟？母親？歸屬感？第六十九頁，共90頁。問題1：克隆人是不是正常的人？怎樣看待克隆人？第七十頁，共90頁。誰生他?誰養(yǎng)他?誰愛他?誰嫁他?克隆人如何生存？前提：與技術(shù)問題脫鉤，只面對情感與倫理。克隆人生出來就是一個與常人無異的人。第七十一頁，共90頁。問題2：英雄、偉人可以再生嗎？

第七十二頁，共90頁。性格與情感上：是否完全一樣？克隆人同正常人一樣有情感和感受，但克隆人的情感和被克隆人并不一樣。雖然一個人的性格一部分由基因決定，是天生的，但外部環(huán)境對形成一個人的性格起更大作用。第七十三頁，共90頁。問題3：身體上任何一部分的細胞是否都可以用來克?。?/p>

第七十四頁，共90頁。問題4：人可以無休止地被克隆嗎？

第七十五頁，共90頁。問題5：是否是人類的倒退？第七十六頁，共90頁。許多國家出臺法律禁止生殖性克隆。?有性生殖是歷史進化的結(jié)果，利于種族繁衍和生存，以及優(yōu)良性狀的形成。選擇無性生殖——克隆的方式不利于遺傳多樣性的保護。從有性繁殖到無性繁殖,就進化而言是一種退化。第七十七頁，共90頁。保證人工受精、胚胎移植不受環(huán)境、地點和時間的限制為建立優(yōu)良動物胚胎庫提供可能第五節(jié)冷凍保存技術(shù)第七十八頁，共90頁。非冷凍保存

胚胎冷藏保存法：一般在0－4℃左右保存冷凍法

是指－196℃保存胚胎，此技術(shù)為建立優(yōu)良品種的胚胎庫或基因庫提供了條件，同時也便于胚胎的運輸與移植。

抗凍保護劑的選擇冷凍方法的選擇

胚胎冷凍保存第七十九頁，共90頁?？箖霰Ｗo劑的選擇①滲透型冷凍保護劑：屬于細胞內(nèi)冷凍保護劑。常見的有甘油、二甲基亞砜、丙二醇和乙二醇。②非滲透型冷凍保護劑：屬于細胞外冷凍保護劑，一般為高分子物質(zhì)。常見的有單糖（葡萄糖）、二糖（蔗糖）、三糖。第八十頁，共90頁。冷凍方法的選擇程序冷凍與復(fù)蘇胚胎①將采集到的胚胎在含20%小牛血清的PBS溶液中洗滌2次。②將洗滌過的胚胎在室溫條件下加入含1.4mol/L甘油和20%小牛血清的PBS的冷凍液中平衡20min。③將胚胎和冷凍液裝入0.25mL胚胎冷凍細管中，封口，并在細管外標記供體號、胚胎數(shù)量、等級、冷凍日期等。第八十一頁，共90頁。④將裝入胚胎的細管放入冷凍儀中，在0℃平衡10min，以1℃/min的速度降至-7至-6℃，平衡10min，然后以0.3℃的速度降溫至-38至-35℃，投入液氮保存。⑤解凍時從冷凍液中取出裝胚胎的細管，在空氣中平衡10s，立即置于37℃水浴解凍，1min后取出完成解凍過程。⑥將細管中的冷凍液及胚胎推出，