淋巴細(xì)胞分離與玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)

淋巴細(xì)胞分離與玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)第一頁，共十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜ち馨图?xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分離方法學(xué)習(xí)E花環(huán)試驗(yàn)的操作方法觀察顯微鏡下E花環(huán)的形態(tài)第二頁，共十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)原理淋巴細(xì)胞成功分離后，便于在體外對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞進(jìn)行鑒定、計(jì)數(shù)或功能測(cè)定；還可以用于E花環(huán)試驗(yàn)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)及淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（需無菌操作）。淋巴細(xì)胞的方便來源是外周血，分離的原則是收率較高，純度較好，失活較低。無論采用哪種方法，應(yīng)最大可能保持細(xì)胞應(yīng)有活性。第三頁，共十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)原理分離的技術(shù)可根據(jù)細(xì)胞的物理性狀和表面標(biāo)志設(shè)計(jì)，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康目刹捎妹芏忍荻入x心法、吸附分離法和其它特殊分離法。第四頁，共十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)采用的是密度梯度離心法。該方法是根據(jù)各類血細(xì)胞比重的差異（外周血中各種細(xì)胞的密度不同，人紅細(xì)胞密度為1.093，粒細(xì)胞為1.092，淋巴細(xì)胞為1.074±0.001），利用比重介于某兩類細(xì)胞之間的細(xì)胞分離液對(duì)血液離心，使一定比重的血細(xì)胞依相應(yīng)的密度梯度分布于不同的獨(dú)立帶，從而達(dá)到分離的目的。第五頁，共十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)原理人T淋巴細(xì)胞表面的CD2分子即綿羊紅細(xì)胞受體（ER），在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，可與綿羊紅細(xì)胞（SRBC）結(jié)合，形成玫瑰花結(jié)，稱為E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)(erythrocyte-roseetteformationtest)。該試驗(yàn)常用于臨床檢測(cè)人外周血T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和比例，由此可間接反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀況。第六頁，共十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)原理T細(xì)胞SRBCE受體（CD2)SRBC受體第七頁，共十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)器材注射器、刻度吸管、毛細(xì)吸管、玻片、試管、離心管肝素、無Ca、Mg的Hanks液、淋巴細(xì)胞分離液、雙蒸水、生理鹽水、0.8%戊二醛、瑞氏染液綿羊紅細(xì)胞懸液（雞紅細(xì)胞懸液）、離心機(jī)、水浴箱、顯微鏡等。第八頁，共十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)步驟1.取1ml豚鼠肝素抗凝血于試管中，加等量Hanks液稀釋，手動(dòng)輕輕搖勻；2.取2ml淋巴細(xì)胞分離液加入15ml離心管中；3.用毛細(xì)吸管吸取抗凝血，將抗凝血全部沿管壁緩慢加入，注意保持兩種液體界面清晰4.室溫下立即置水平式離心機(jī)以2000rpm離心20分鐘，離心后分為4層。5.用毛細(xì)吸管仔細(xì)吸取血漿與分層液界面處單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）層至一刻度離心管內(nèi)。6.加入5倍以上體積的Hanks液洗滌3次，每次以2000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀主要為單個(gè)核細(xì)胞）。第九頁，共十五頁，2022年，8月28日豚鼠背足靜脈取血一人抓住豚鼠，將其左或右后肢膝關(guān)節(jié)伸直；另一人消毒豚鼠的腳背面并找出背中足靜脈，以左手的拇指和食指拉住其趾端；右手持注射器刺入靜脈，徐徐抽取血液，達(dá)所需量時(shí)，拔出針頭，用無菌棉球壓迫止血。第十頁，共十五頁，2022年，8月28日稀釋的血液分離液離心稀釋的血液分離液稀釋的血漿單個(gè)核細(xì)胞分層液粒細(xì)胞、紅細(xì)胞第十一頁，共十五頁，2022年，8月28日外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）主要指T、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞，是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的細(xì)胞群，PBMC的分離也是進(jìn)行T細(xì)胞和B細(xì)胞分離純化的重要中間環(huán)節(jié)。第十二頁，共十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)步驟5.取一定量的兔血于離心管中，用無Ca、Mg的Hanks液洗滌3次，每次離心1500rpm5min。將壓積RBC配制成1%紅細(xì)胞懸液。6.取0.1ml淋巴細(xì)胞懸液，加入等量1％RBC懸液和0.1ml小牛血清混勻，37℃水浴15min，500rpm離心5min，取出.（直接取樣，滴加事先滴有美蘭染液的載玻片上，計(jì)數(shù)早期RE花環(huán)）7.置于4℃冰箱20min，小心吸去上清，沿管壁加1－2滴0.8%戊二醛，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)試管小心混勻。8.置于4℃冰箱15min，取出涂片，待自然干燥后，瑞氏染色，鏡下觀察。

第十三頁，共十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)數(shù)花環(huán)個(gè)數(shù)，結(jié)合3個(gè)以上的SRBC為一個(gè)花環(huán)，計(jì)算活性E花環(huán)形成率，正常值為50%-80%。E花環(huán)形成率＝形成花結(jié)的淋巴細(xì)胞數(shù)/淋巴細(xì)胞總數(shù)

（形成花結(jié)+未