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文檔簡介

細胞凋亡與疾病醫(yī)學院生理與病理生理學系

12023/3/31內(nèi)容第一節(jié):概述第二節(jié):細胞凋亡的形態(tài)及生化改變第三節(jié):細胞凋亡發(fā)生途徑與調(diào)控第四節(jié):細胞凋亡異常與疾病22023/3/31

第一節(jié)

概述32023/3/31增殖分化凋亡胚胎發(fā)育和機體的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)細胞數(shù)量和質(zhì)量的控制42023/3/31阿伯丁大學的希臘語系教授提出apoptosis這個希臘字眼。于是,凋亡這個詞從此登上了生物學語言的歷史舞臺。

1965年洛克辛(Lockshin)和威廉姆斯(Williams)提出發(fā)育調(diào)節(jié)性死亡(developmentregulateddeath)。1972年英國阿伯?。ˋberdeen)大學的病理學家克瑞(Kerr)發(fā)表了他在小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)的與壞死有本質(zhì)區(qū)別的細胞死亡方式,他將之命名為漸進性壞死(necrobiosis)。

凋亡(apoptosis)的由來及研究簡史52023/3/31apoptosis凋亡(from)apoptosis(fall)απτωστσαποπτωστσ62023/3/31ApoptosispublicationsperyearNumberofpublications72023/3/31●2002諾貝爾生理學和醫(yī)學獎授予了在器官發(fā)育和程序性細胞死亡研究領域中做出奠基性貢獻的3位科學家:Johnsulston,RobertHorvitz,Sydneybrenner

●創(chuàng)造性地用線蟲作為實驗模型,實現(xiàn)了對器官發(fā)育過程中細胞分裂、分化的原位觀察,完成了細胞圖譜的繪制●發(fā)現(xiàn)調(diào)控器官發(fā)育程序性細胞死亡的關鍵基因及其功能并進一步在高等哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了相關功能基因SydneybrennerJohnsulstonRobertHorvitz82023/3/31雌雄同體的秀麗新小桿線蟲(C.elegans)92023/3/31模式生物(animalmodel)

C.

elegans:1090cellscaenorhabditiselegans

deathgene(CED)102023/3/31細胞死亡的形式

壞死(necrosis)

凋亡(apoptosis)自噬(autophagy)副凋亡(paraptosis)

脹亡(oncosis)

……112023/3/31真核生物細胞內(nèi)自噬(autophagy)的過程122023/3/31壞死(necrosis)

:由于某些外界因素導致細胞急速的病理性死亡。細胞凋亡(apoptosis):由體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)預存的死亡程序而導致的細胞死亡過程。necrosis=細胞意外性死亡apoptosis=細胞自發(fā)性死亡132023/3/31

細胞凋亡(apoptosis)又稱程序性細胞死亡(programmedcelldeath),是通過基因調(diào)控而出現(xiàn)的主動、有序的細胞生理性消亡過程。142023/3/31區(qū)別壞死凋亡性質(zhì)病理性,非特異性生理性或病理性,特異性誘導因素強烈刺激,隨機發(fā)生較弱刺激,非隨機發(fā)生基因調(diào)控無有DNA電泳彌散性降解,電泳成均一DNA片狀DNA片段化,電泳呈梯狀條帶形態(tài)變化細胞結構全面溶解,破壞、細胞腫脹細胞膜及細胞器相對完整細胞皺縮,核固縮炎癥反應溶酶體破裂,局部炎癥反應溶酶體相對完整,局部無炎癥反應凋亡小體無有生化特點被動過程,無新蛋白合成,不耗能主動過程,新蛋白合成,耗能152023/3/31

1、確保組織器官正常發(fā)育、生長

2、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定

3、發(fā)揮積極的防御功能凋亡的生理學意義對于一個8-14歲的兒童來說,平均每天有200-300億個細胞發(fā)生凋亡。162023/3/31凋亡在小鼠腳趾形成中的作用172023/3/31蝌蚪向蛙發(fā)育的變態(tài)反應中凋亡的作用182023/3/31Developmentally-regulatedapoptosis192023/3/31202023/3/31

第二節(jié)

細胞凋亡的形態(tài)及生化改變212023/3/31一、凋亡的形態(tài)特征(Themorphologiccharacteristicsofapoptosis)

胞膜空泡化(blebbing)固縮(condensation)出芽(budding)染色質(zhì)邊集(margination)凋亡小體(apoptosisbody)222023/3/31Necrosis232023/3/31Apoptosis胞膜空泡化(blebbing)固縮(condensation)出芽(budding)染色質(zhì)邊集(margination)凋亡小體(apoptosisbody)242023/3/31CellDeath

A:necrosis,

diedinaculturedish

B:apoptosis,

C:apoptosis,

diedinaculturedishdiedinadevelopingtissueengulfedbyaneighboringcell.252023/3/31二、凋亡的生化特征DNA片段化內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活凋亡蛋白酶激活(Thebiochemicalcharacteristicsofapoptosis)262023/3/31JClinPathol:MolPathol2000;53:55–63272023/3/31282023/3/31內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶Ca2+Mg2+DNAZn2+內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶Ladderpattern++292023/3/31

凋亡蛋白酶

Caspase激活含半胱氨酸的天冬氨酸特異蛋白酶

(半胱天冬酶)Cysteine-containingaspartate-specificprotease,(Caspase)302023/3/31

Caspase家族成員特性一覽表

名稱原名功能底物特異性Caspase-1ICE輔助促炎癥YVADCaspase-2ICH-1凋亡反應VDVADCaspase-3CPP32,Yama,apopain凋亡反應DEXDCaspase-4ICErel-II,TX,ICH-2輔助促炎癥LEVDCaspase-5ICErel-III,TY輔助促炎癥WEHDCaspase-6Mch-3凋亡反應VEIDCaspase-7Mch3,ICE-LAP3,CMH-1凋亡反應Caspase-8MACH,FLICE,Mch5凋亡反應IETDCaspase-9ICE-LAP6,Mch6凋亡反應LEHDCaspase-10Mch4凋亡反應AEVDCaspase-11ICH-3Caspase-12Caspase-13ERICELEEDCaspase-14MICE(Mini-ICE)注:W為色氨酸,E谷氨酸、H為組氨酸、D為天冬氨酸、I為異亮氨酸、L為亮氨酸、V為纈氨酸、X為任何氨基酸(byThonberry,1997)312023/3/3120040484MechanismofcaspaseactivationDimerizationcomposedoftwolarge(~20kDa)andtwosmall(~10kDa)subunits.zymogenactivatedcaspaseprodomainsmalllargeprodomainSelf-cleavage,othercaspasesAspAsplargesmalllargesmall322023/3/311、相似的氨基酸序列、結構、底物特異性2、通常以酶原形式存在3、NH2末端結構域、大亞基、小亞基4、高度特異啟動型Caspase(caspase2,8,9,10)效應型Caspase(capases3,6,7,14)炎癥介質(zhì):(caspase-1,11)Caspase特點:332023/3/31滅活凋亡抑制蛋白:直接作用于細胞結構并使之解體:核膜lamins分解與細胞骨架構成相關的蛋白瓦解核結構成核碎片Caspase功能endonucleaseassociatewithinhibitor(ICAD)Caspase3cleavedactivatedDNAdegradationDNA“l(fā)adder”patternCaspase-activateddeoxyribonuclease(CAD)Blebing,condensation,margination,apoptosisbody342023/3/31

第三節(jié)

細胞凋亡發(fā)生途徑與調(diào)控352023/3/31凋亡過程可大致分成3個階段凋亡相關信號的作用及其啟動的相關信號轉導

相關基因接受死亡信號后按預定程序啟動合成執(zhí)行凋亡所需的各種酶類底物降解誘導期效應期降解期362023/3/31誘導期凋亡相關信號受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺(第二信使)胞內(nèi)信號轉導途徑激活凋亡程序死亡信號啟動預定程序凋亡相關基因激活酶合成核酸內(nèi)切酶激活Caspases激活DNA切割細胞解體凋亡效應期降解期

凋亡的過程(Theprocessofapoptosis)巨噬細胞吞噬分解凋亡細胞372023/3/31細胞凋亡調(diào)控相關的信號生理性凋亡相關信號病理性凋亡相關信號某些激素和細胞因子的直接作用某些激素和細胞因子的間接作用誘導凋亡:生物及射線、化學毒素、病毒感染、應激、化療藥、營養(yǎng)因素缺乏、過度功能負荷抑制凋亡:各種化學促癌物、某些病毒(EB病毒)382023/3/31392023/3/31凋亡的信號轉導系統(tǒng)1)死亡受體介導的凋亡通路2)線粒體介導的凋亡通路3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激啟動的凋亡通路402023/3/31Fas配體(FasL)死亡受體(Fas)靶細胞細胞膜DDDDDDDDFADD連接蛋白DEDCaspase-8

酶原活化的Caspase-8DISC復合物BidtBid激活線粒體凋亡通路激活Caspase-3Caspase-9Caspase-6,7

細胞凋亡死亡受體介導的凋亡通路FASassociateddeathdomain,FADDTNFR1associateddeathdomain,TRADDdeath–inducingsignalingcomplex,DISCTNF-α、FasL、TWEAK、TRAILFAS,TNFR1,DR3、4、5412023/3/31凋亡誘導信號?ψm下降PTP開放caspase-3AIF核酸內(nèi)切酶蛋白質(zhì)水解DNA斷裂細胞凋亡(+)(+)線粒體途徑介導的凋亡通路PermeabilitytransitionporeBcl-2IAPSmac/Diablo射線化療藥氧化應激鈣穩(wěn)態(tài)失衡422023/3/31內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)啟動的細胞凋亡432023/3/31內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)啟動的細胞凋亡442023/3/31正常細胞細胞凋亡促進ICE、BaxFas、p53抑制Bcl-2、EIBIAP

細胞凋亡相關基因促凋亡因子抗凋亡因子452023/3/31Bcl-2(B細胞淋巴瘤/白血病-2,Bcelllymphoma/leukemia-2)Bcl-2subfamily(pro-survival):Bcl-2,Bcl-XLBaxsubfamily(pro-apoptotic):Bax,BakBH3subfamily(pro-apoptotic):Bad,Bid462023/3/31Bcl-2(B細胞淋巴瘤/白血病-2,Bcelllymphoma/leukemia-2)抗凋亡的機制1、直接的抗氧化2、抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì)3、抑制促凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax、Bak的細胞毒作用4、抑制caspase的激活5、維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)472023/3/31G1(RNA、蛋白質(zhì)合成)S(DNA復制階段)G2MG1SG2M監(jiān)控P53染色體有缺陷P53CDI表達、DNA修復機制的啟動細胞凋亡啟動Molecularpoliceman482023/3/311、啟動線粒體凋亡途徑的凋亡相關基因組2、啟動死亡受體凋亡途徑的凋亡相關基因組3、負調(diào)控細胞生存及增殖信號途徑的磷酸酯酶相關基因組p53作為反轉錄激活因子,調(diào)控三組功能各異相關基因的表達:p53還可轉位到線粒體,模擬BH3-only樣蛋白的功能直接誘導細胞凋亡。492023/3/31C-myc雙向調(diào)節(jié)作用c-myc蛋白是轉錄調(diào)節(jié)因子BclxBcl-XL抑制細胞凋亡Bcl-Xs促進細胞凋亡502023/3/31Caspases內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶其他

細胞凋亡的執(zhí)行512023/3/31吞噬細胞對凋亡細胞的識別與吞噬吞噬細胞凝集素(lectin)的作用血小板反應蛋白(thrombospondin,TSP)介導吞噬磷脂酰絲氨酸受體的作用522023/3/31磷脂酰絲氨酸外翻分析(AnnexinV法)

532023/3/31誘導期凋亡相關信號受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺(第二信使)胞內(nèi)信號轉導途徑激活凋亡程序死亡信號啟動預定程序凋亡相關基因激活酶合成核酸內(nèi)切酶激活Caspases激活DNA切割細胞解體凋亡效應期降解期

凋亡的過程(Theprocessofapoptosis)巨噬細胞吞噬分解凋亡細胞542023/3/31

第四節(jié)細胞凋亡異常與疾病552023/3/31(Thediseasesassociatedwithapoptosisdysregulation)組織器官的退行性病變或早衰自身免疫性疾病或腫瘤凋亡亢進細胞凋亡失調(diào)性疾病凋亡抑制細胞凋亡不足細胞凋亡過度細胞凋亡不足與過度并存562023/3/31腫瘤的發(fā)病途徑細胞增殖過度細胞凋亡受抑細胞死亡不足細胞存活>死亡腫瘤的發(fā)生Bcl-2mtP53572023/3/31腫瘤細胞凋亡不足的相關機制:調(diào)控凋亡相關信號的異常誘導凋亡相關信號轉導通路的障礙實施凋亡相關基因表達的異常執(zhí)行凋亡相關酶活性的異常582023/3/31自身免疫病與非己抗原-MHC抗原結合的TcR單陽性細胞正選擇Positiveselection與自身抗原-MHC抗原結合的TcR雙陽性細胞負選擇Negativeselection凋亡×自身免疫病592023/3/31細胞凋亡過度Gp120糖蛋白的表達合胞體的形成Fas基因表達的上調(diào)T細胞的激活細胞因子(TNF)的分泌Tat蛋白的產(chǎn)生感染的CD4+淋巴細胞誘導未感染的CD4+淋巴細胞凋亡AIDS602023/3/31細胞凋亡過度與心臟疾病

氧化應激Fas上調(diào)P53基因轉錄

凋亡指數(shù):發(fā)生凋亡的細胞核數(shù)/100個細胞核35.5%vs.0.2%-0.4%612023/3/31阿爾茨海默病(AD)622023/3/31血漿中LDL(氧化型)升高血小板激活AngⅡ高血壓內(nèi)皮細胞凋亡凋亡率:34%正常凋亡率:8%血管血管平滑肌增生超過凋亡動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)632023/3/31細胞凋亡在疾病防治中的意義利用凋亡相關因素FAS/FASL信號系統(tǒng)干預凋亡信號轉導調(diào)節(jié)凋亡相關基因控制凋亡相關酶學機制核酸內(nèi)切酶防止線粒體跨膜電位環(huán)胞霉素A642023/3/31附:細胞凋亡的形態(tài)學檢測方法光學顯微鏡

熒光顯微鏡(Hoechst33342,Hoechst33258,DAPI)電子顯微鏡

652023/3/31熒光顯微鏡觀察AO-EB染色法hoechst33258染色法正常細胞核凋亡細胞核662023/3/31電子顯微鏡觀察672023/3/31細胞凋亡的生物化學檢測方法磷脂酰絲氨酸外翻分析(AnnexinV法)線粒體膜勢能的檢測JC-1DNA片斷化檢測DNALadder測定DNA含量分析TUNEL法682023/3/31磷脂酰絲氨酸外翻分析(AnnexinV法)

692023/3/31不同凋亡階段的區(qū)分702023/3/31流式細胞儀分析(FACS)712023/3/31原理:JC-1染料在正常細胞內(nèi)聚集在線粒體內(nèi),形成多聚體,發(fā)紅色熒光;而在凋亡細胞內(nèi),由于線粒體膜電位的破壞,不能聚集到線粒體內(nèi),以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。線粒體膜勢能(JC-1)的檢測熒光顯微鏡檢測FACS檢測722023/3/31JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒檢測結果:

732023/3/31線粒體膜勢能的檢測(JC-1)742023/3/31DNA片斷化檢測DNALadder752023/3/31DNA含量分析DNADamage2N4N2N4NG1SG2/M762023/3/31

細胞凋亡中,染色體

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