實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)一

實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)（一）

蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)3/31/20231實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈽?gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要連接方式了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。N端C端3/31/20232西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室定量測(cè)定蛋白質(zhì)的方法：凱氏定氮法雙縮脲法茚三酮法Folin-酚（lowry法）考馬斯亮藍(lán)G250法紫外吸收法3/31/20233西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室雙縮脲反應(yīng)蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量氨基酸成分無(wú)關(guān)，因此利用此進(jìn)行比色測(cè)定蛋白質(zhì)含量。在一定條件下，未知樣品的溶液與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液同時(shí)反應(yīng)，并于540—560nm下比色，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知的蛋白質(zhì)濃度，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液可以用結(jié)晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。實(shí)驗(yàn)原理3/31/20235西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)原理在弱酸條件下（pH5-7），蛋白質(zhì)或氨基酸與茚三酮共熱，可生成藍(lán)紫色縮合物。

此反應(yīng)為一切蛋白質(zhì)和α-氨基酸所共有(亞氨基酸如脯氨酸和羥脯氨酸產(chǎn)生黃色化合物)。

含有氨基的其他化合物亦可發(fā)生此反應(yīng)。

3/31/20236西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)原理黃色反應(yīng)蛋白質(zhì)溶液遇硝酸后先產(chǎn)生白色沉淀加熱則白色沉淀變成黃色再加堿顏色加深呈橙黃色這是因?yàn)橄跛釋⒌鞍踪|(zhì)分子中的苯環(huán)硝化產(chǎn)生了黃色硝基苯衍生物(硝醌酸鈉）。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)均含有芳香族氨基酸，因此都有黃色反應(yīng)硝基酚(黃色)鄰硝醌酸鈉(橙黃色)3/31/20237西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)儀器及試劑考馬斯亮藍(lán)G2500.5%苯酚濃硝酸0.1%茚三酮尿素1%硫酸銅2%卵清蛋白溶液3/31/20239西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)步驟雙縮脲反應(yīng)取少量尿素結(jié)晶于干燥的試管中，用微火加熱熔化→尿素重又開(kāi)始硬化時(shí)停止加熱→可見(jiàn)到氨氣釋出→冷卻后加入10%NaOH溶液約1ml，振蕩混勻→加1%CuSO4溶液1滴，振蕩→觀察顏色變化取1ml卵清蛋白溶液于干燥的試管中→加10%NaOH溶液約2ml，搖勻→加1%CuSO4溶液2滴，隨加隨振蕩→觀察顏色變化茚三酮反應(yīng)取兩只試管，分別加入2%的卵清蛋白溶液和0.5%的Gly

溶液1ml→各加0.5ml0.1%的水合茚三酮溶液，混勻→在沸水浴中加熱1~2min→觀察顏色變化在一小塊濾紙上滴一滴0.5%的Gly

溶液→風(fēng)干→在原處滴一滴0.1%的茚三酮-乙醇溶液→將濾紙?jiān)谖⒒鹋院娓伞^察顏色變化3/31/202310西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室管號(hào)123456材料(滴)雞蛋清溶液4滴指甲少許頭發(fā)少許0.5%苯酚4滴0.3%Trp4滴0.3%Tyr4滴濃硝酸(滴)24040444待個(gè)試管出現(xiàn)黃色后，在室溫下逐滴加入10%NaOH溶液至堿性，觀察顏色變化.現(xiàn)象解釋黃色反應(yīng)3/31/202311西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室實(shí)